4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
1.2.11 Các yếu tố khác ảnh hƣởng đến nuôi cấy in vitro
1.2.11.1 Amino acid hoặc nitơ bổ sung
Mặc dù tế bào nuôi cấy thƣờng có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết, việc bổ sung các amino acid nhất định hoặc hỗn hợp amino acid có thể đƣợc sử dụng để tiếp tục kích thích tăng trƣởng tế bào. Việc sử dụng các amino acid đặc biệt quan trọng cho việc thiết lập môi trƣờng nuôi cấy tế bào và môi trƣờng nuôi cấy các kiểu mẫu đầu tiên. Amino acid cung cấp nitơ ngay lập tức cho tế bào thực vật nhƣ một nguồn có sẵn, nói chung chúng có thể đƣợc đƣa lên bởi hệ thống mạch dẫn trong tế bào nhanh hơn so với nitơ vô cơ.
Các nguồn nitơ hữu cơ phổ biến nhất đƣợc sử dụng trong môi trƣờng nuôi cấy in vitro là hỗn hợp các amino acid (casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagin và adenine).
Casein hydrolysate
Casein hydrolysate đƣợc sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật chủ yếu đƣợc sử dụng làm nguồn bổ sung amino acid. Casein hydrolysate nói chung đƣợc sử dụng với nồng độ 0,05 - 0,1%. Khi bổ sung casein hydrolysate và các chất khoáng của môi trƣờng MS vào giai đoạn ổn định của quá trình nuôi cấy cho thấy sự sinh trƣởng của tế bào cao hơn khoảng 50 - 60% so với đối chứng.
Việc cung cấp các amino acid ngoại sinh trong môi trƣờng nuôi cấy có thể thúc đẩy quá trình tạo mô sẹo và tái sinh phôi ở một số loài thực vật. Casein hydrolysate là một nguồn cung cấp vitamin, các nguyên tố vi lƣợng khác nhau và quan trọng nhất là hỗn hợp của tới 18 loại amino acid. Nhiều nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng casein hydrolysate có hiệu quả hơn đối với nuôi cấy mô thực vật so với việc bổ sung các amino acid chính [34];[35].
L-tyrosine
L-tyrosine đƣợc xem là nguồn nitrogen hữu cơ thƣờng sử dụng trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào thực vật, đƣợc sử dụng để kích thích hình thái trong nuôi cấy tế bào nhƣng chỉ nên đƣợc sử dụng trong môi trƣờng thạch.
34
Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhƣng sự bổ sung các amino acid vào môi trƣờng nuôi cấy là để kích thích sự tăng trƣởng của tế bào.
Adenin sulphate
Adenin sulphate là tiền chất của cytokinin, thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy in vitro các giống chuối Musa sp.. Adenin sulphate đƣợc sử dụng trong nuôi cấy in vitro nhƣ một chất bổ sung kích thích tăng trƣởng tế bào, tỷ lệ phát sinh chồi. Adenin kích thích sự phát sinh phôi soma và phát sinh cơ quan, gia tăng sự sinh trƣởng của các đỉnh mô phân sinh biệt lập, bao gồm sƣ tăng nhanh của chồi nách trong nuôi cấy chồi và kích thích phát sinh chồi bất định gián tiếp từ mô sẹo hay trực tiếp từ mẫu cấy [36]. Ảnh hƣởng của adenin sulphate lên khả năng tạo chồi có thể do tính chất của cytokinin. Khi có mặt adenin sulphate trong môi trƣờng, các chồi đơn sử dụng adenin sulphate làm tiền chất để tổng hợp ra cytokinin nội sinh. Adenin sulphate đƣợc sử dụng trong nuôi cấy in vitro giúp tăng nhanh số lƣợng cây giống trên đối tƣợng đu đủ [37]. Trên đối tƣợng cây cọc rào đã chỉ ra rằng adenin sulphate kích thích tạo phôi vô tính từ mô sẹo, đạt hiệu quả cao nhất ở nồng độ là 150 mg/l khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy [38].
Myo-inositol
Myo-inositol là một trong những thành phần chủ yếu trong các môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật đƣợc sử dụng để lƣu trữ phosphat, sinh tổng hợp tế bào, sản xuất các phân tử liên quan đến stress, truyền thông giữa tế bào với tế bào, lƣu trữ và vận chuyển các hoocmon thực vật.
- Lƣu trữ phosphat: Myo-inositol tham gia vào việc bảo quản phosphat trong hạt. Phosphat là chất dinh dƣỡng quan trọng của thực vật. Thực vật lƣu trữ các chất dinh dƣỡng quan trọng vào hạt giống của chúng để hỗ trợ sự phát triển sớm của cây con [39].
- Sinh tổng hợp tế bào thực vật: Myo-inositol cũng là một phân tử thiết yếu để sản xuất thành tế bào thực vật. Vách tế bào thực vật đƣợc làm chủ yếu bằng các chuỗi đƣờng đƣợc gọi là polysaccharide. Một dạng oxy hóa của
35
myo-inositol là đƣờng phổ biến và quan trọng nhất liên quan đến việc sản xuất polysaccharide cho thành tế bào. Ngoài việc tổng hợp thành tế bào, các đƣờng dẫn xuất myo-inositol này cung cấp các thành phần quan trọng khác liên quan đến lƣu trữ, vận chuyển và phát triển [40].
- Myo-inositol ảnh hƣởng đến khả năng chịu mặn: Myo-inositol và các phân tử liên quan góp phần bảo vệ thực vật chống lại stress muối. Myo- inositol và các phân tử liên quan đƣợc cho là có liên quan khả năng chịu mặn theo hai cách chính: (1) để bảo vệ cấu trúc tế bào khỏi các chất oxi hóa phản ứng nhƣ hydrogen peroxide, và (2) để kiểm soát áp suất nƣớc trong tế bào. Đã có gợi ý rằng thay đổi sinh tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol và myo- inositol có thể tạo khả năng chịu mặn đối với các loài cây trồng [41].
- Truyền thông tin giữa các tế bào: Cây cối, cũng nhƣ động vật, đòi hỏi khả năng phản ứng với môi trƣờng của chúng. Các sinh vật sử dụng các đƣờng dẫn tín hiệu hóa học để chuyển thông tin giữa các tế bào. Myo-inositol là một thành phần thiết yếu của con đƣờng tín hiệu trong thực vật đƣợc gọi là con đƣờng tín hiệu PI. Con đƣờng này đã đƣợc chứng minh là tham gia vào một loạt phản ứng của cây trồng bao gồm khả năng rễ phát triển hƣớng xuống dƣới khi phản ứng với lực hấp dẫn và áp suất thay đổi trong các lỗ lá kiểm soát việc héo [42].
- Lƣu trữ và vận chuyển hormon thực vật: Myo-inositol cũng phục vụ để lƣu trữ và vận chuyển một nhóm các hormone thực vật quan trọng, gọi là auxin. Hormone thực vật kiểm soát sự phát triển của mô thực vật. Myo- inositol liên kết với các auxin hình thành các hợp chất hormone tạm thời không hoạt động. Những hợp chất không hoạt động này cho phép lƣu trữ an toàn và vận chuyển auxin, có thể điều chỉnh sự có sẵn của auxin hoạt động để đáp ứng sinh lý [43].
Một số nghiên cứu cho thấy khi môi trƣờng nuôi cấy bổ sung 100 mg/l myo-inositol có ảnh hƣởng đến sự gia tăng chồi in vitro chuối Cavendish [44]. Trên cây Haworthia cũng nhận thấy có sự gia tăng chồi và rễ khi môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung myo-inositol [45].
36
1.2.11.2 Ảnh hưởng của dịch chiết hữu cơ
Bổ sung các loại dịch chiết xuất hữu cơ vào môi trƣờng nuôi cấy thƣờng dẫn đến các tác động thuận lợi trong quá trình nuôi cấy. Các loại dịch chiết hữu cơ bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đã đƣợc thử nghiệm bao gồm nƣớc dừa, dịch thủy phân protein, peptone, cao nấm men, dịch chiết xuất mạch nha, dịch chiết chuối, nƣớc cam và nƣớc cà chua. Tuy nhiên, việc bổ sung các dịch chiết hữu cơ vào môi trƣờng nuôi cấy vẫn chƣa xác định đƣợc vai trò nên đƣợc sử dụng nhƣ một phƣơng pháp bổ sung, ngày nay chỉ có nƣớc dừa và dịch thủy phân protein thƣờng đƣợc bổ sung vào các loại môi trƣờng nuôi cấy.
Cao nấm men (YE)
Cao nấm men chứa nhiều chất dinh dƣỡng thiết yếu cho cây trồng ngoài amino acid, vitamin (vitamin B, glutathione) trong cao nấm men còn chứa các khoáng chất (Zn, Ca và Co), carbohydrate và muối [46]. Do đó, chúng có khả năng thúc đẩy tăng trƣởng thực vật bằng cách cung cấp cho tế bào thực vật nguồn nitơ hữu cơ [47]. Trƣớc đây, cao nấm men đƣợc sử dụng nhƣ là chất dinh dƣỡng kích thích tăng trƣởng nhƣ trong nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng và nuôi cấy mô sẹo. Hiện nay, cao nấm men thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ một elicitor sinh học để cảm ứng và tăng cƣờng sản xuất các hợp chất thứ cấp từ thực vật. Nhiều thông tin cho rằng cao nấm men đƣợc sử dụng nhƣ là một chất bổ sung để thúc đẩy sự tăng trƣởng ở thực vật, do có hàm lƣợng amino acid cao [48]. Tuy nhiên, tùy vào các loài khác nhau mà có những đáp ứng theo những cách khác nhau khi có sự hiện diện của cao nấm men, cao nấm men bổ sung ở nồng độ cao trong môi trƣờng MS, ức chế sự tăng trƣởng của cây trồng trong khi đó, ở nồng độ thấp cao nấm men đã cho thấy có lợi. Trong nuôi cấy mô cao nấm men lần đầu tiên đƣợc sử dụng và có tác động tích cực lên sự hình thành và phát triển rễ cà chua trong ống nghiệm. Thành phần hóa học của cao nấm men ít đƣợc chú ý phân tích, chủ yếu chứa: đƣờng, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, muối khoáng. Tác dụng của cao nấm men với rễ rất tốt nhƣng với callus thì không r ràng. Cao nấm men đƣợc biết đến nhƣ nguồn cung cấp các amino acid và các vitamin, đặc biệt là inositol và thiamine (B1) [49].
37
Trong môi trƣờng chỉ có thành phần dinh dƣỡng đa lƣợng và vi lƣợng, thì việc cung cấp cao nấm men là thiết yếu cho sự phát triển của tế bào thực vật. Phần trăm các amino acid trong cao nấm điển hình cao khoảng 7% amino nitrogen [50], nhƣng ít glutamic acid hơn casein hay trong các protein thủy phân khác. Cao nấm men thƣờng đƣợc thêm vào môi trƣờng với nồng độ 0,1 - 1,0 g/l; có khi lên tới 5, 10 g/l hay thậm chí là 20 g/l. Vai trò của cao nấm men thƣờng giúp cho sự phát triển của thực vật trong môi trƣờng tƣơng đối thấp nồng độ nitơ hoặc thiếu nitơ.
Vai trò của cao nấm men có liên quan tới những amino acid hiện diện trong thành phần của cao nấm men. Chúng kích thích quá trình tích lũy phytoalexin ở một số loài thực vật và ở huyền phù Glycyrrhiza echinata kích thích hoạt động tổng hợp chalcone dẫn đến hình thành naringin. Cao nấm men cũng kích thích tạo thành furamocoumarin trong huyền phù tế bào Glehnia littoralis.
Peptone
Peptone là các chất hoà tan thu đƣợc khi protein đƣợc hydro hoá hoặc qua phản ứng của enzyme (pepsin, papain, pancreatin,...). Chúng thƣờng ở dạng bột trắng hoặc vàng nhạt và có khả năng hút ẩm rất cao, peptone cũng có thể ở dạng dung dịch. Những loại chính là: peptone thịt, peptone men, peptone máu và peptone casein. Peptone có chứa các thành phần thiết yếu nhƣ: peptide, amino acid, các muối vô cơ cũng nhƣ các hợp chất khác nhƣ chất béo, vitamin và đƣờng [51]. Trƣớc đây, peptone đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật nhƣ là nguồn cung cấp carbon và nitơ cho cây trồng. Có ý kiến cho rằng ở một nồng độ hiệu quả, sự kết hợp của nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ có thể thúc đẩy sự phát triển của mẫu cấy [52]. Gần đây, vai trò đặc biệt của peptone đã đƣợc chứng minh nhƣ là yếu tố kích thích sự tăng trƣởng và phát triển của các mô thực vật. Khi đƣợc sử dụng trong môi trƣờng ban đầu, peptone có chức năng nhƣ một elicitor của sự hình thành rễ tóc nhân sâm [53] và cảm ứng tạo phôi của cây Oncidium [52]. Môi trƣờng nuôi cấy bổ sung thành phần peptone có ảnh hƣởng đến sự biệt hóa và nảy mầm của cây hoa anh thảo, nồng độ peptone thích hợp là 0,25% (w/v) [54].
38
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU