THẢO
1. Định tính saponin trong cây cam thảo
Hiện nay, dựa vào những tính chất đặc trưng của Saponin chúng ta có rất nhiều cách để định tính chúng như: định tính Saponin dưa trên tính phá huyết, dựa trên tính tạo bọt, dựa trên độ độc với cá, dựa trên khả năng tạo phức với Cholesterol, hoặc là dựa trên các phản ứng màu, định tính bằng sắc ký lớp mỏng.
Đối với Saponin trong cây Cam Thảo người ta thường sử dụng ba phương pháp để định tính Saponin đó chính là: định tính dựa trên tính tạo bọt, phản ứng màu Liebermann-Burchard, sắc ký lớp mỏng.
a) Định tính Saponin trong cây cam thảo dựa trên tính tạo bọt- Chuẩn bị thí nghiệm - Chuẩn bị thí nghiệm
Nguyên liệu, dung môi và hoá chất
o Rễ và than rễ của cây cam thảo
o Nước cất, NaOH 0.1N, HCl 0.1N
Dụng cụ:
o Bếp đun, 3 ống nghiệm, cốc thuỷ tinh, giấy lọc và các dụng cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm khác,…
- Các bước tiến hành:
Chế biến cam thảo thành dạng bột.
Lấy 1g bột cam thảo hoà vào nước cất sau đó đem đun cách thuỷ trong 30 phút, thu được dịch chiết.
Lọc nóng dịch chiết và cho một lượng dịch lọc vào ống nghiệm 1
Lắc đều ống nghiệm theo chiều dọc khoảng 30 lần ( khoảng 1 phút).
Để yên ống nghiệm trong 15 phút. Ta thấy ống nghiệm có cột bọt bền.
Lấy 2 thể tích dịch chiết bằng nhau cho vào 2 ống nghiệm (2 và 3).
Cho 1ml NaOH 0.1N vào ống nghiệm 2, 1ml HCl 0.1N vào ống nghiệm 3.
Lắc đều cả 2 ống nghiệm trong khoảng 30 giây sau đó để yên cho cột bọt ổn định.
Ta thấy chiều cao của cột bọt của 2 ống nghiệm bằng nhau
- Giải thích hiện tượng và kết luận:
Chiết bột dược liệu bằng nước vì Saponin có tính phân cực mạnh.
Saponin có tính hoạt động bề mặt do phân tử Saponin có 1 đầu kị nước và một đầu ưa nước nên khi hoà tan vào dung dịch sẽ làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch, tạo nhiều bọt khi lắc dung dịch.
Dây khung của Steroid dể bị khử bởi acid nên sẽ tạo ra sự chênh lệch về chiều cao bọt, còn dây khung của Triterpen thì bền hơn nên sẽ cân bằng về chiều cao cột bọt.
Khi quan sát kết quả thí nghiệm của ống nghiệm 1, ta thấy dịch chiết Cam Thảo có bọt bền, ta có thể kết luận rằng trong Cam Thảo có chứa Saponin.
So sánh chiều cao cột bọt của 2 ống nghiệm 2 và 3 ta kết luận Saponin trong Cam Thảo là Saponin Triterpenoid.
b) Định tính Saponin trong cây Cam Thảo bằng phản ứng màu Liebermann-Burchard Burchard
- Chuẩn bị thí nghiệm
o Nguyên liệu, dung môi, hoá chất:
Rễ và than rể của cây cam thảo được sơ chế thành bột Cồn 70%, Anhydric Acetic, CHCl3, H2SO4 đđ,
o Dụng cụ:
Bếp đun, bông lọc, ống nghiệm, cốc thuỷ tinh, các vật dụng cơ bản của phòng thí nghiệm,…
- Tiến hành thí nghiệm:
o Cân 0,5g bột Cam Thảo, thêm vào 5ml cồn 70%, đun cách thuỷ hỗn hợp trên trong 5 phút.
o Lọc bằng bông, thu được dịch chiết.
o Tiếp tục đun cách thuỷ dịch chiết, thu được cắn.
o Hoà tan cắn vào 1ml Anhydric Acetic và 1ml CHCl3.
o Cho 1ml H2SO4 vào hỗn hợp trên.
o Ta thấy dung dịch tách lớp, lớp dung dịch phía trên có màu nâu đỏ.
- Giải thích hiện tượng và kết luận
o Ở thí nghiệm này, ta dùng cồn để chiết là để hạn chế sự thuỷ phân Saponin cũng như hoà tan một số tạp chất khác có thể làm sai lệch kết quả thí nghiệm. Sau đó tiếp tục chiết với CHCl3 để chiết
Sapogenin.
o Phản ứng đặc hiệu lên màu với các dẫn chất có nhân Steroid, cơ chế của phản ứng là sự khử nước của acid mạnh.
o Ta kết luận Saponin trong Cam Thảo là Saponin Triterpenoid.
c) Định tính Saponin trong Cam Thảo bằng sắc ký lớp mỏng- Chuẩn bị thí nghiệm: - Chuẩn bị thí nghiệm:
o Nguyên liệu, dung môi, hoá chất: Bột cam thảo
Dung môi CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10) 25
MeOH
o Dụng cụ:
Bảng mỏng được tráng sẵn Silicagel Cốc thuỷ tinh, bến đun, bình sắc ký Các dụng cụ phòng thí nghiệm khác
- Tiến hành thí nghiệm:
o Cân 0.5g bột Cam Thảo thêm vào 5ml Methanol, đun cách thuỷ trong 15 phút
o Lọc, cô đặc dịch lọc.
o Cắt bảng mỏng thành hình chữ nhật có kích thước 1cm x 10 cm, kẻ thêm vạch xuất phát ở cuối bảng.
o Cho hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O vào bình sắc ký, sau cho chiều cao mực dung môi ko vượt quá vạch xuất phát.
o Dùng mao quản chấm dịch chiết vào bảng mỏng, đợi MeOH bay hết, cho vào bình sắc ký đã chuẩn bị.
o Đợi dung môi trong bình chạy hết bảng mỏng, tiến hành đánh dấu các vết trên bảng mỏng.
o Đo độ dài từ vạch xuất phát đến vết, từ vạch xuất phát đến hết bảng (độ dài từ vạch xuất phát đến dung môi).
o Tính Rf theo công thức:Rf = độdài dungmôi c ạyđộdài c ấtℎ điđượcℎ được
- Giải thích hiện tượng và kết luận:
o Mỗi chất sẽ có hình dạng vết và Rf khác nhau. Nên ta có thể dựa vào chúng để xác định thành phần các chất có trong dung dịch
o Qua tính toán và so sánh, ta có thể xác định trong Cam Thảo có chứa Saponin.
2. Định lượng Saponin trong cây Cam Thảo
a) Định lượng Saponin bằng phương pháp cân
Đây là phương pháp truyền thống để định lượng Saponin. Người ta tiến hành định lượng bằng cách chiết tách Saponin ra khỏi Cam Thảo sau đó cân Saponin. Phương pháp này cho độ chính xác không cao.
b) Định lượng Saponin bằng phương pháp đo quang
- Đối với Saponin trong Cam Thảo, người ta thường sử dụng thuốc thử là Vanillin-Sulfuric với dung môi Methanol.
- Tiến hành chiết Cam Thảo bằng Methanol
- Cho lần lượt thuốc thử Vanillin-Sulfuric biết trước nồng độ vào máy đo quang UV-Vis với bước song từ 400nm-700nm. Dựng đường chuẩn từ nồng độ và độ hấp thu quang.
- Cho dịch chiết Cam Thảo vào máy đo quang đo độ hấp thu. Dựa vào độ hấp thu và đường chuẩn ta xác định được nồng độ Saponin trong Cam Thảo
c) Định lượng Saponin bằng sắc ký lỏng cao áp
Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp hiện nay được sử dụng nhiều trong định tính, định lượng các chất nói chung và saponin nói riêng. Người ta có thể thực hiện định tính 1 thành phần hay đồng thời nhiều thành phần trong hỗn hợp.
Pha tĩnh cho sắc ký lỏng cao áp với các saponin thường là pha đảo PR- 18. Pha tĩnh theo cơ chế rây phân tử cũng có thể được dùng.
Hệ dung môi sử dụng trong sắc ký là hỗn hợp nước – methanol – acetonitril với các tỉ lệ khác nhau, có hay không có dung dịch đệm. Chương trình dung môi có thể là isocratic hay gradient.
Detector dùng để phát hiện gồm xác định chỉ sổ khúc xạ (RI), hay tán xạ bay hơi (ELSD), detector có nhiều ưu điểm nhất hiện nay là detector khối phổ (MS hay MS/MS với kỹ thuật ion hóa ESI hay APCI). Do các
saponin ít cso các nối đôi, nhất là nối đôi liên hợp nên thường chỉ có hấp thu tử ngoại ở vùng sóng ngắn 210 -195 nm nên việc sử dụng detector UV tương đối hạn chế trong phân tích saponin.