Thời gian: Từ ngày 25/1/2007 đến ngày 25/5/2007
Địa điểm
Địa điểm lấy mẫu: Mẫu được lấy tại các trại chăn nuơi gà đẻ trứng thương phẩm ở các huyện Trảng Bom, Vĩnh Cửu, Long Thành, Tân Phú, Xuân Lộc, Thống Nhất và Thị Xã Long Khánh Tỉnh Đồng Nai.
Địa điểm xét nghiệm: Trạm chẩn đốn xét nghiệm - Chi cục Thú Y tỉnh Đồng Nai.
3.2. Vật liệu Mẫu xét nghiệm
Mẫu huyết thanh gà đẻ trứng thương phẩm Isabrow. Số lượng 1330 mẫu.
Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Thiết bị: Máy ly tâm, máy lắc Multishaker, máy lắc Vortex, tủ mát (4-80C), tủ âm (-200C)
Dụng cụ: Micropipette 1 đầu (kênh), micropipette 12 đầu (kênh), đồng hồ bấm giờ, kim tiêm lấy máu, máng nhựa đựng hĩa chất, hộp đựng đầu type, chai lọđựng hĩa chất, vỉ làm phản ứng ngưng kết (đáy chữ U), ống chứa mẫu Eppendorf, găng tay, khẩu trang, bơng, cồn, túi nilon đựng mẫu, hộp đựng mẫu, đá lạnh bảo quản mẫu.
Hĩa chất: NaCl, KCl, NaHPO4, KH2PO4, NaOH, HCl, nước cất, dung dịch Phosphate bufer saline 0,01M (PBS ).
Kháng nguyên Newcastle chuẩn do Trạm chẩn đốn xét nghiệm – Chi cục thú y
Đồng Nai cung cấp.
Huyễn dịch hồng cầu gà 1%. 3.3. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát hiệu giá kháng thể chống bệnh Newcastle trên đàn gà đẻ trứng thương phẩm tại 7 huyện, thị thuộc tỉnh Đồng Nai.
Đánh giá khả năng tạo kháng thể theo huyện, thị, theo nhĩm lứa tuổi và theo quy mơ chăn nuơi.
3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Bố trí lấy mẫu xét nghiệm
Mẫu huyết thanh: Lấy ngẫu nhiên theo các trại chăn nuơi ở 7 huyện, thị thuộc tỉnh Đồng Nai.
Để tính tốn số mẫu cần lấy chúng tơi dựa vào phần mềm Win-episcope 2.0 với các thơng số như sau: Tổng đàn: 650570 con, tỉ lệ bảo hộước đốn: 90%, sai số: 5%, độ tin cậy: 95%.
Số lượng mẫu huyết thanh cần thiết cho việc khảo sát được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.1: Bố trí lấy mẫu huyết thanh gà
STT Huyện, thị xã Số lượng trại Số lượng mẫu 1 2 3 4 5 6 7 Vĩnh Cửu Tân Phú TX.Long Khánh Xuân Lộc Trảng Bom Long Thành Thống Nhất 2 2 16 7 18 4 7 50 50 220 110 620 170 110 Tổng cộng 56 1330
3.4.2. Phương pháp lấy mẫu
Lấy mẫu huyết thanh:
- Một người dùng tay trái giữ hai chân gà, tay phải giữ hai cánh gà (lật ngửa). - Một người chuẩn bị ống tiêm và thực hiện lấy máu: dùng cồn sát trùng vị trí lấy máu và thực hiện lấy máu ở tĩnh mạch cánh của gà (với số lượng khoảng 2ml đến 3ml máu/con). Sau khi lấy máu song đậy ống tiêm lại và để nghiêng chờ máu đơng tự nhiên rồi cho vào thùng lạnh. Tất cả các mẫu sau khi thu thập đều được đánh dấu theo kí hiệu cĩ kèm theo danh sách với đầy đủ các chi tiết cụ thể như: địa điểm lấy mẫu
(tên trại, huyện), lồi, giống, lứa tuổi, ngày tiêm vaccine…Khi về phịng thí nghiệm mẫu được ly tâm tách lấy huyết thanh và cho vào eppendorf.
Bảo quản mẫu
- Mẫu huyết thanh phải được bao gĩi cẩn thận tránh ơ nhiễm mơi trường xung quanh.
- Bảo quản và vận chuyển trong điều kiện lạnh (từ 2-80C).
- Mẫu huyết thanh được gửi đến phịng xét nghiệm càng sớm càng tốt, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm.
- Nếu mẫu chưa được xét nghiệm ngay trong vịng 48-72 giờ thì nên giữ trong tủ âm sâu (-700C).
3.4.3. Chuẩn bị huyễn dịch hồng cầu 1%
Gà lấy máu là gà trống đã trưởng thành khỏe mạnh, chưa tiêm phịng Newcastle và kiểm tra khơng cĩ hàm lượng kháng thể chống bệnh Newcastle.
Dùng bơm tiêm từ 5ml đến 10ml, hút sẵn 1ml dung dịch chống đơng (Natri xitrat 4%, Alsever,…) rồi hút lấy máu gà (ở tĩnh mạch cánh hoặc tim gà). Cho máu vào ống nghiệm.
Rửa hồng cầu: Cho nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào ống nghiệm, một lượng gấp đơi lượng máu trong ống, lắc đều. Ly tâm từ 1500 vịng/phút đến 2000 vịng/phút, trong 10 phút, đổ bỏ huyết tương ở trên.
Rửa như trên từ 2 đến 3 lần, sau lần ly tâm cuối bỏ nước ở trên để lấy hồng cầu đặc.
Sau khi hồng cầu đã được rửa song ta pha thành huyễn dịch hồng cầu 1% (1ml hồng cầu + 99ml nước muối sinh lý).
Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ 4-80C.
3.4.4. Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (Haemagglutination Test)
Nguyên lý: Trên bề mặt virus Newcastle cĩ cấu trúc kháng nguyên H (Haemagglutinin) cĩ khả năng kết hợp với các thụ thể trên bề mặt hồng cầu của các lồi gà, vịt, bị sát, chuột, bị, heo, người…làm ngưng kết các loại hồng cầu này.
Trình tự tiến hành phản ứng:
Trên một hàng giếng (12 giếng), dùng micropipette hút cho vào vĩ nhựa theo trình tự sau:
- Cho 25 µl PBS vào tất cả các giếng từ 1đến 12 (theo hàng). - Cho kháng nguyên chuẩncần kiểm tra vào giếng 1 (25 µl).
- Pha lỗng kháng nguyên: Trộn đều kháng nguyên với dung dịch PBS ở giếng 1, hút 25 µl chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng 3 trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11, hút bỏ 25 µl đi.
- Cho hồng cầu 1% vào mỗi giếng từ 1 đến 12 (theo hàng) với số lượng 25µl, lắc nhẹ 1 phút. Đểđĩa phản ứng ở nhiệt độ phịng, sau 15-30 phút đọc kết quả. Bảng 3.2: Sơ đồ thực hiện phản ứng HA Giếng Các chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Dung dich PBS (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 KN chuẩn (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Bỏ 25 - Độ pha lỗng KN 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 - Huyễn dịch HC 1% (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Trộn đêu để yên 15-30 phút Kết quả (HC: hồng cầu; KN: kháng nguyên)
Đọc kết quả
Phản ứng dương tính: cĩ hạt ngưng kết lấm chấm.
Phản ứng âm tính: hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm trịn ( đĩng nút ). Hiệu giá ngưng kết được tính ởđộ pha lỗng kháng nguyên cao nhất cịn xuất hiện ngưng kết hồn tồn.
Giả sử từ giếng 1 đến giếng 8 là dương tính (hồng cầu ngưng kết ) ta đọc hiệu giá ngưng kết là 1/256.
- Giếng thứ 8 cĩ nồng độ kháng nguyên tương ứng 1 đơn vị HA. - Giếng thứ 7 cĩ nồng độ kháng nguyên tương ứng 2 đơn vị HA. - Giếng thứ 6 cĩ nồng độ kháng nguyên tương ứng 4 đơn vị HA.
Để dùng cho phản ứng HI, ta sử dụng kháng nguyên pha theo nồng độ virus đạt 4 đơn vị HA/25µl.
3.4.5 Xác định hiệu giá kháng thể kháng Newcastle
Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI (Haemagglutination Inhibition Test ). Nguyên lý: Khi kháng thể cĩ trong huyết thanh của gà gặp virus Newcastle tương ứng sẽ xảy ra phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể. Do đĩ khi thêm hồng cầu gà vào thì khơng xảy ra hiện tượng ngưng kết. Ngược lại nếu kháng thể khơng tương ứng với kháng nguyên (virus Newcastle) thì cĩ hiện tượng ngưng kết hồng cầu gà.
Mục đích: xác định hàm lượng kháng thể chống bệnh Newcastle trên đàn gà.
Trình tự tiến hành phản ứng:
- Cho 25 µl PBS vào tất cả các giếng từ 1-12 (theo hàng). - Cho huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1 (25 µl).
- Pha lỗng huyết thanh: trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng 1, rồi hút 25 µl chuyển sang giếng 2 trộn đều, hút 25 µl chuyển sang giếng 3, tiếp tục làm như vậy đến giếng 10, đổ bỏ 25 µl đi.
- Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào giếng 1 đến giếng 11, mỗi giếng 25 µl. - Lắc nhẹđể 5 - 10 phút ở nhiệt độ phịng.
- Cho hồng cầu 1% vào mỗi giếng từ 1 đến 12 (theo hang) với số lượng 25 µl, lắc nhẹ 1 phút. Đểđĩa phản ứng ở nhiệt độ phịng sau 15-30 phút.
Chú ý:
- Giếng 11: Đối chứng (-). Gồm 25µl PBS + 25µl kháng nguyên virus (4 đơn vị HA) + 25µl huyễn dịch hồng cầu gà 1%. - Giếng 12: Đối chứng . Gồm 25µl PBS + 25µl huyễn dịch hồng cầu gà 1%. Bảng 3.3: Sơ đồ thực hiện phản ứng HI Giếng Các Chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Dung dịch PBS(µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 HT gà(µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Bỏ 25 - - Độ pha lỗng HT 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 - - KN virus(µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Lắc nhẹ, để yên 30 phút Huyễn dịch HC 1% (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Kết quả
( ĐC: Đối chứng; HC: Hồng cầu ; KN: kháng nguyên ; HT: Huyết thanh) Đọc kết quả
Khi giếng 12 cĩ hiện tượng đĩng nút hồng cầu và giếng 11 cĩ hiện tượng ngưng kết ta bắt đầu đọc kết quảở mỗi giếng phản ứng.
Phản ứng dương tính: Hồng cầu khơng bị ngưng kết (đĩng nút). Phản ứng âm tính: Hồng cầu bị ngưng kết.
Hiệu giá kháng thể chống bệnh Newcastle là độ pha lỗng cao nhất của huyết thanh cho phản ứng dương tính.
Giả sử từ giếng 1 đến giếng 4 cĩ hiện tượng đĩng nút hồng cầu cịn từ giếng 5 trở đi cĩ hiện tượng ngưng kết, thì ta nĩi ở độ pha lỗng 1/16 huyết thanh vẫn cịn tính ngăn trở ngưng kết hồng cầu ở 4 đơn vị HA. Như vậy huyết thanh gà cần xét nghiệm cĩ hiệu giá kháng thể HI = 1/16.
Theo quy định của cơng ty chăn nuơi gia cầm trung ương thì hiệu giá kháng thể HI ≥1/16 là cĩ khả năng bảo hộ cho đàn gà chống bệnh Newcastle.
Nếu từ lỗ đầu tiên trở đi khơng cĩ hiện tượng đĩng nút mà là ngưng kết thì kháng huyết thanh gà cần xét nghiệm cĩ hiệu giá HI = 0.