3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết cây địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng
Tiến hành điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số hộ trồng địa lan trên địa bàn TP. Đà Lạt từ đó xác định đƣợc tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra. Hình thức điều tra: phỏng vấn, trao đổi, trò chuyện với từng hộ sản xuất.
3.2.2. Phân lập mẫu vi khuẩn
Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại các vƣờn địa lan bị bệnh tại thành phố Đà Lạt. Tiến hành phân lập mẫu trên môi trƣờng PGA.
Cách phân lập mẫu: mẫu bệnh đƣợc phân lập từ vết bệnh điển hình. Cắt lấy
mảnh nhỏ có kích thƣớc 3 – 5 mm 3 – 5 mm tại vị trí giữa mô bệnh và mô khỏe. Rửa mẫu bằng nƣớc cất 2 – 3 lần rồi khử trùng mẫu bệnh bằng cồn 700 trong 30 giây, sau đó
rửa lại bằng nƣớc cất 2 – 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ cấy. Chú ý không nên để mẫu quá khô. Sau đó đặt mẫu lên môi trƣờng PGA, để ở nhiệt độ phòng. Khi vi khuẩn mọc cấy chuyền sang đĩa khác để tạo dòng thuần.
Cách đặt tên mẫu: EC06 – 1 là mẫu vi khuẩn đƣợc phân lập từ các mẫu bệnh trên
cây địa lan tại Đà Lạt năm 2006, mẫu 1. (E: Erwinia carotovora subsp. carotovora, C:
Cymbidium).
Sau đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra gram âm, gram dƣơng các dòng vi khuẩn vừa phân lập đƣợc. Kiểm tra nhanh bằng cách sử dụng KOH 3%. Nhỏ một giọt KOH lên phiến kính, sau đó dùng tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy một ít vi khuẩn từ khuẩn lạc huyền phù trong giọt KOH đó khoảng 2 – 3 phút, nếu nhớt là gram âm ngƣợc lại là gram dƣơng.
3.2.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC
Trên môi trƣờng KB: dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi
khuẩn cấy chấm điểm lên môi trƣờng KB. Sau 24 giờ đem chiếu dƣới tia UV và quan sát sự phát sáng của vi khuẩn.
Trên môi trƣờng YDC: tƣơng tự nhƣ cấy lên môi trƣờng KB. Sau 24 giờ quan
sát sự tạo sắc tố và hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn.
3.2.4. Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan
Thí nghiệm tiến hành chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan với 17 mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc: EC06-1, EC06-3, EC06-5, EC06-6, EC06-7, EC06-8, EC06-9, EC06-10, EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-14, EC06-15, EC06-16, EC06- 17, EC06-18, EC06-19. Mỗi mẫu phân lập là một công thức, mỗi công thức tiến hành trên một mẩu củ khoai tây và một lá địa lan, bố trí thí nghiệm 2 lần lặp lại. Các mẩu củ khoai tây và lá địa lan không để vi khuẩn vào dùng làm đối chứng.
Tiến hành chủng bệnh vi khuẩn trên củ khoai tây Vật liệu
- Vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YDC.
- Củ khoai tây bi không bị sâu bệnh. - Hộp nhựa có kích thƣớc 20 8 cm.
Phƣơng pháp
- Các hộp nhựa đƣợc khử trùng bằng cồn 700, dƣới đáy hộp có đặt một lớp giấy thấm. Sau đó nhỏ nƣớc cất đã hấp tiệt trùng lên lớp giấy thấm để tạo độ ẩm.
- Củ khoai tây đƣợc rửa sạch và khử trùng bề mặt bằng cồn 700. Để khô tự nhiên sau đó dùng dao đã đƣợc khử trùng cắt thành từng miếng nhỏ và đặt vào hộp. Lấy một miếng thạch có chứa khuẩn lạc vi khuẩn và đặt vào chính giữa mẩu khoai tây. Sau đó, tất cả các hộp đƣợc để trong điều kiện nhiệt độ phòng.
Đánh giá kết quả: theo dõi xem sau khi chủng bệnh vi khuẩn bao nhiêu ngày thì
củ khoai tây bị bệnh và mô tả triệu chứng bệnh.
Tiến hành chủng bệnh vi khuẩn lên lá địa lan Vật liệu
- Vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YDC.
- Lá địa lan cùng tuổi (tuổi 2) không bị sâu bệnh. - Hộp nhựa có kích thƣớc 20 8 cm.
- Giấy thấm đã sấy tiệt trùng, nƣớc cất, cồn 700.
Phƣơng pháp
- Các hộp nhựa đƣợc khử trùng bằng cồn 700, dƣới đáy hộp có đặt một lớp giấy thấm. Sau đó nhỏ nƣớc cất đã hấp tiệt trùng lên lớp giấy thấm để tạo độ ẩm.
- Lấy lá địa lan không bị sâu bệnh rửa sạch và khử trùng bề mặt bằng cồn 700. Làm khô tự nhiên sau đó dùng dao lam sạch cắt một đoạn khoảng 20 cm và đặt vào hộp.
- Dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn chấm lên vết cắt.
- Sau khi chủng xong các hộp mẫu đƣợc để ở trong phòng lạnh 250C.
Đánh giá kết quả: theo dõi xem sau khi chủng bệnh bao nhiêu ngày thì lá địa lan
bị bệnh và mô tả triệu chứng bệnh. Sau đó, lấy lá địa lan bị bệnh phân lập lại và xác định tác nhân gây bệnh. Cách phân lập mẫu: lấy lá địa lan bị bệnh cho vào cốc nƣớc sạch đã hấp tiệt trùng rửa sạch 2 – 3 lần, khử trùng mẫu bằng cồn 700 trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất 2 – 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ cấy. Đặt mẫu lên môi trƣờng PGA và để ở nhiệt độ phòng. Khi vi khuẩn mọc lên thì quan sát và mô tả.
3.2.5. Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng
Dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn cho vào ống nghiệm đựng 5 ml môi trƣờng LB đã hấp tiệt trùng và đậy lại bằng nút bông gòn. Các ống nghiệm này đƣợc gói lại thành bó và cho vào máy lắc . Sau 48 giờ tăng sinh dịch vi khuẩn thu đƣợc đem ly tâm để thu sinh khối sau đó tiến hành ly trích.
3.2.6. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn
Phƣơng pháp ly trích DNA đƣợc thực hiện theo quy trình của Sambrook và ctv, 2001: Phƣơng pháp sử dụng CTAB/NaCl đã có cải tiến. Quy trình thực hiện nhƣ sau:
-Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm dịch vi khuẩn 10.000 vòng/5 phút/4oC. Rửa sinh khối thu đƣợc với 1ml nƣớc cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (thƣờng 2- 3 lần).
-Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567 μl dung dịch TE và đánh tan bằng vortex, thêm 30 μl dung dịch SDS 10% và đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 – 2 giờ.
-Cho thêm vào 100 μl dung dịch NaCl , hòa tan thật kỹ bằng vortex.
-Thêm vào 80 μl dung dịch CTAB/NaCl ( khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ ở 650C/10 phút.
-Thêm vào 780 μl dung dịch hỗn hợp Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1:v/v). Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 12.000 vòng/10 phút/4oC.
-Thu hết dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào eppendorf mới. Nếu không thể phân biệt mặt phân cách chung giữa các dung dịch có thể ly tâm thêm lần nữa ở tốc độ lớn hơn.
-Chiết xuất dung dịch DNA với Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1:v/v). Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14.000 vòng/10 phút/4oC. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào eppendorf mới (khoảng 500 μl).
-Kết tủa DNA với dung dịch Isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích của dung dịch (khoảng 300 μl) và ủ ở tủ - 20oC/30 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/10 phút/40C. Thu lấy kết tủa sau khi ly tâm.
-Rửa kết tủa bằng Ethanol 70% (khoảng 500 μl).Tốt hơn có thể dùng Ethanol 70% đƣợc làm lạnh – 200C, nghiêng nhẹ qua lại. Ly tâm 13.000 vòng/10 phút/4oC. Đổ cồn ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi.
-Hòa tan kết tủa trong 40 μl dung dịch TE, đem giữ trong tủ mát 40C trong suốt thời gian thử nghiệm.
3.2.7. Thực hiện phản ứng PCR
Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322
Sử dụng cặp primer có các thông số sau: nhiệt độ Tm: 60,70C và 53,60C, %GC: 61,9% và 47,6%, trình tự primer: Xan 1330 (5'- GTTCCCGGGCCTTGTACACAC - 3') và Xan 322 (5'-GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC - 3'). Hai primer này đƣợc thiết kế trên vùng 16S/23S rDNA cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb (Khoodoo và ctv, 2004). Thành phần phản ứng Thành phần 10X buffer PCR MgCl2 50 mM dNTP's 10 mM Xan 1330 100 pmol/μl Xan 322 100 pmol/μl
Taq DNA polymerase 5 UI/μl DNA mẫu
H2O cất
Chu kỳ nhiệt
Các bƣớc của phản ứng Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (30 chu kỳ) - Biến tính
- Bắt cặp - Kéo dài
Giai đoạn kết thúc 720C 5 phút Giữ ở 40C
Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2
Sử dụng cặp primer có các thông số nhƣ sau: nhiệt độ Tm: 84,90C và 73,70C, %GC: 66% và 50%, trình tự primer: Erw1 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCG- <T>- 3') và Erw2 (5'- CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAG-<T>- 3'). Hai primer này đƣợc thiết kế trên vùng gen mã hóa pectate lyase của vi khuẩn Erwinia carotovora cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc 434 bp (Darrasse và ctv, 1994).
Thành phần phản ứng
Thành phần Nồng độ cuối 10X buffer PCR 1X
MgCl2 50 mM 1.5 mM
dNTP's 10 mM 0.2 mM/mỗi loại Erw1 75 pmol/μl 10 pmol/μl
Erw2 83 pmol/μl 10 pmol/μl
Taq DNA polymerase 5 UI/μl 1UI
H2O cất vừa đủ 25 μl
Chu kỳ nhiệt: chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo quy trình của
Seo và ctv, 2001.
Các bƣớc của phản ứng Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (35 chu kỳ) - Biến tính
- Bắt cặp - Kéo dài
Giai đoạn kết thúc Giữ ở 40C
Tùy theo sản phẩm PCR, các điều kiện của phản ứng PCR sẽ đƣợc điều chỉnh trong quá trình làm để thu đƣợc kết quả tốt nhất.
Điện di và đọc kết quả PCR
Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, lấy eppendorf ra khỏi máy luân nhiệt. Sản phẩm PCR sẽ đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose.
Chuẩn bị gel cho quá trình điện di: cách chuẩn bị gel nhƣ sau: cân 0,125g
agarose, thêm 12,5 ml TAE 0.5X, đun trong lò viba ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thƣờng đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 600C (đến khi nào cầm đƣợc mà không quá nóng) thì đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lƣợc đã cân bằng. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lƣợc ra khỏi gel và cho vào bồn điện di có chứa TAE 0,5X sẵn sàng cho việc đặt mẫu.
Tiến hành điện di: trộn dung dịch gồm 4 μl sản phẩm PCR và 2 μl loading dye
6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di 40 – 50 phút với cƣờng độ dòng điện là 250 mA và hiệu điện thế 50V.
Nhuộm mẫu: sau khi điện di, gel đƣợc lấy ra khỏi bồn điện di và ngâm vào dung
dịch EtBr trong khoảng 15 – 20 phút.
Quan sát kết quả điện di: kết quả điện di đƣợc quan sát dƣới tia UV nhờ vào
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng
Hoa lan cũng giống nhƣ các loại cây cảnh khác thƣờng xuyên bị sâu bệnh gây hại làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng bình thƣờng, năng suất, phẩm chất trong đó có màu sắc, hƣơng vị, độ tƣơi bền dẫn đến làm giảm giá trị kinh tế, giá trị thẩm mỹ, giá trị hàng hóa và xuất khẩu trên thị trƣờng trong và ngoài nƣớc, thậm chí còn làm chết cây. Hiện nay, tình hình bệnh hại nhất là bệnh chết cây địa lan đã gây thiệt hại rất lớn cho ngƣời nông dân trồng địa lan tại TP. Đà Lạt. Do đó, việc tiến hành điều tra tình hình bệnh hại và xác định tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật.
4.1.1. Các triệu chứng bệnh trên địa lan: Qua điều tra cho thấy một số bệnh thƣờng
xuất hiện trên địa lan với triệu chứng bệnh nhƣ sau:
Trên chồi địa lan
(a) (b)
Hình 4.1.Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan.
a. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu vàng. b. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu đen.
Trên giả hành
(a) (b)
(c) (d)
Hình 4.2. Các triệu chứng bệnh trên giả hành.
a. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng thối nâu vàng. b. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng thối nâu đen. c. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng khô giả hành. d. Chậu địa lan với giả hành và chồi bệnh.
Trên phát hoa
(a) (b)
Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh trên phát hoa.
a. Phát hoa địa lan với triệu chứng thối nâu vàng. b. Phát hoa địa lan với triệu chứng thối nâu đen.
4.1.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệuđiều tra tháng 10 năm 2005) điều tra tháng 10 năm 2005)
Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra. Vƣờn điều tra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Tổng cộng
Qua đánh giá kết quả từ bảng 4.1, tỉ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra nhƣ sau: bệnh do
nh ( % ) bệ ễm lệ n hi T ỉ Tác nhân gây bệnh Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra.
Bệnh thối làm chết cây địa lan đang ảnh hƣởng rất nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn cho ngƣời trồng lan. Qua điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn gây ra cao hơn hẳn so với tỉ lệ nhiễm bệnh do nấm và virus gây ra qua các vƣờn điều tra (bảng 4.1 và đồ thị 4.1), có vƣờn không bị nhiễm bệnh hoặc chỉ bị nhiễm bệnh do hai tác nhân gây ra. Nhƣ thế, không thể kết luận đƣợc vƣờn đó là hoàn toàn sạch bệnh mà nó có thể bị bệnh tiềm ẩn, chƣa biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân góp phần làm cho bệnh lây lan và phát triển mạnh. Ngoài các yếu tố tự nhiên thì kỹ thuật trồng và chăm sóc của nông dân cũng ảnh hƣởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh. Họ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chƣa có quy trình kỹ thuật hợp lý.
4.2. Phân lập mẫu vi khuẩn
Theo Nguyễn Văn Minh (2005), qua điều tra và phỏng vấn ở những vƣờn địa lan có bệnh chết cây xuất hiện và vƣờn không có bệnh, cho thấy nhận thức của các chủ vƣờn về bệnh này còn kém. Phần lớn các chủ vƣờn đều nhận biết đƣợc triệu chứng bệnh và điều kiện giúp cho bệnh phát triển mạnh, nhƣng đa số các hộ trồng chƣa phân biệt đƣợc bệnh có bao nhiêu triệu chứng và nguyên nhân gây ra.
Kết quả điều tra cho thấy, bệnh do vi khuẩn gây ra chiếm tỉ lệ cao hơn cả. Trƣớc tình hình đó, chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu chồi địa lan có triệu chứng bệnh do vi khuẩn gây ra và tiến hành phân lập. Kết quả là phân lập đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng trên môi trƣờng PGA (Hình 4.4):
a. Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
b. Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. Erwinia carotovora subsp. carotovora là vi khuẩn gram âm. Cho nên chúng tôi
tiến hành kiểm tra gram âm, gram dƣơng để loại bỏ những dòng vi khuẩn gram dƣơng bằng cách sử dụng KOH 3%. Tuy nhiên, cách kiểm tra này cũng không cho kết quả thật chính xác. Có thể bị nhầm lẫn giữa gram âm và gram dƣơng đối với những vi khuẩn có thời gian nuôi lâu, nó cũng tạo nhớt khi huyền phù trong KOH.
(a) (b)
Hình 4.4. Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh trên môi trƣờng PGA.
a. Khuẩn lạc màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. b. Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn.
4.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC4.3.1. Trên môi trƣờng KB 4.3.1. Trên môi trƣờng KB
Môi trƣờng KB đƣợc dùng để xem sự phát sáng của vi khuẩn khi chiếu dƣới tia