Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322
Sử dụng cặp primer có các thông số sau: nhiệt độ Tm: 60,70C và 53,60C, %GC: 61,9% và 47,6%, trình tự primer: Xan 1330 (5'- GTTCCCGGGCCTTGTACACAC - 3') và Xan 322 (5'-GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC - 3'). Hai primer này đƣợc thiết kế trên vùng 16S/23S rDNA cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb (Khoodoo và ctv, 2004). Thành phần phản ứng Thành phần 10X buffer PCR MgCl2 50 mM dNTP's 10 mM Xan 1330 100 pmol/μl Xan 322 100 pmol/μl
Taq DNA polymerase 5 UI/μl DNA mẫu
H2O cất
Chu kỳ nhiệt
Các bƣớc của phản ứng Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (30 chu kỳ) - Biến tính
- Bắt cặp - Kéo dài
Giai đoạn kết thúc 720C 5 phút Giữ ở 40C
Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2
Sử dụng cặp primer có các thông số nhƣ sau: nhiệt độ Tm: 84,90C và 73,70C, %GC: 66% và 50%, trình tự primer: Erw1 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCG- <T>- 3') và Erw2 (5'- CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAG-<T>- 3'). Hai primer này đƣợc thiết kế trên vùng gen mã hóa pectate lyase của vi khuẩn Erwinia carotovora cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc 434 bp (Darrasse và ctv, 1994).
Thành phần phản ứng
Thành phần Nồng độ cuối 10X buffer PCR 1X
MgCl2 50 mM 1.5 mM
dNTP's 10 mM 0.2 mM/mỗi loại Erw1 75 pmol/μl 10 pmol/μl
Erw2 83 pmol/μl 10 pmol/μl
Taq DNA polymerase 5 UI/μl 1UI
H2O cất vừa đủ 25 μl
Chu kỳ nhiệt: chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo quy trình của
Seo và ctv, 2001.
Các bƣớc của phản ứng Giai đoạn khởi động Chạy chu kỳ (35 chu kỳ) - Biến tính
- Bắt cặp - Kéo dài
Giai đoạn kết thúc Giữ ở 40C
Tùy theo sản phẩm PCR, các điều kiện của phản ứng PCR sẽ đƣợc điều chỉnh trong quá trình làm để thu đƣợc kết quả tốt nhất.
Điện di và đọc kết quả PCR
Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, lấy eppendorf ra khỏi máy luân nhiệt. Sản phẩm PCR sẽ đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose.
Chuẩn bị gel cho quá trình điện di: cách chuẩn bị gel nhƣ sau: cân 0,125g
agarose, thêm 12,5 ml TAE 0.5X, đun trong lò viba ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thƣờng đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 600C (đến khi nào cầm đƣợc mà không quá nóng) thì đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lƣợc đã cân bằng. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lƣợc ra khỏi gel và cho vào bồn điện di có chứa TAE 0,5X sẵn sàng cho việc đặt mẫu.
Tiến hành điện di: trộn dung dịch gồm 4 μl sản phẩm PCR và 2 μl loading dye
6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di 40 – 50 phút với cƣờng độ dòng điện là 250 mA và hiệu điện thế 50V.
Nhuộm mẫu: sau khi điện di, gel đƣợc lấy ra khỏi bồn điện di và ngâm vào dung
dịch EtBr trong khoảng 15 – 20 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quan sát kết quả điện di: kết quả điện di đƣợc quan sát dƣới tia UV nhờ vào
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN