NHIỆT ĐỘ
Chúng tôi tiến hành tối ƣu quy trình PCR nhƣ nồng độ mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ DNA để đảm bảo quy trình nhân dòng gen đặc hiệu và ổn định. Trong đó, phản ứng tối ƣu nhiệt độ gắn mồi là một trong những phản ứng quan trọng quyết định hiệu suất PCR, cũng nhƣ từ đó đƣa ra quyết định đâu là chỉ thị phân tử phù hợp để phân loại loài rong Câu. Dựa theo quy trình PCR sử dụng bộ KIT MyTaq™ DNA Polymerase hãng Bioline, DNA rong đƣợc tiến hành khuếch đại gen COI , COI-5P, và rbcLS với gradient nhiệt độ bắt cặp lần lƣợt là 53 oC, 52 oC, 51 oC, 50 oC, 49oC ở Hình 3.6.
Hình 3.62. Kết quả điện di thể hiện sự ảnh hƣởng của nhiệt độ bắt cặp lên khuếch đại 3 chỉ thị phân tử COI, COI-5P, và rbcLS với nồng độ gel agarrose 1% ở 87V
trong 40 phút. (a) marker rbcLS; b) marker COI-5P;(c) marker COI; M: ladder 10000bp; (-): đối chứng âm
a )
c)
31
Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại marker rbcLS
(hình 3.6) chỉ ra độ sáng của band giảm dần khi tăng nhiệt độ. Bên cạnh đó, ở tất cả các giếng đều xuất hiện band có kích thƣớc khoảng 3.000bp với các band không đặc hiệu ở nhiều vị trí khác nhau. Thí nghiệm này đã đƣợc lặp lại tối thiểu 3 lần để tránh lỗi thao tác và thay đổi nồng độ primer (20µM/L và 10µM/L); tuy nhiên, tất cả đều cho ra kết quả tƣơng tự.
Với cặp mồi rbcLS3F, rbcLSS97R [30] đã khuếch đại đoạn trình tự ở rong Nâu có kích thƣớc 735 bp gồm 513 bp của vùng bên sƣờn (flanking region) rbcL, 155bp của vùng đệm hoàn chỉnh (complete spacer), 67 bp của vùng bên sƣờn rbcS. Tuy vậy, kết quả hình ảnh điện di (hình 3.10a) không xuất hiện band mục tiêu nên có thể kết luận cặp mồi nhƣ trên không đặc hiệu để nhân bản vùng đặc điệu rbcLS cho các loài rong đỏ. Ngoài ra, theo nghiên cứu Mattio và ctv (2010) đã so sánh khả năng hoạt động hiệu quả của 5 marker rbcLS, COI, mtps, cox3 và ITS-2 trong định danh loài Sargassum chỉ ra rbcLS không phải là “ứng cử viên” tốt để định danh loài rong nâu. Nhƣ đã đề cập ở phần tổng quan, hiện chƣa có bài báo cáo áp dụng marker rbcLS trong định danh loài rong đỏ, mà chỉ phố biến với marker rbcL nên khó có thể chắc chắn rằng marker này rbcLS không phù hợp để định danh loài rong đỏ hay do trình tự cặp mồi không phù hợp để nhân bản. Tuy nhiên, có thể đƣa ra kết luận rằng chỉ thị phân tử rcbLS không là marker đặc hiệu để định danh các loài rong câu cho nghiên cứu này.
Ở hình 3.6c, tƣơng tự nhƣ marker rbcLS, cặp mồi COXI43F, COXI1549R [21] không phù hợp để khuếch đại gen COI của loài rong câu. Hình 3.6b cho thấy độ sáng của band giảm dần theo nhiệt độ và xuất hiện band không đặc hiệu ở vị trí gần 2.000bp và band mục tiêu có kích thƣớc ≈ 1.000bp. Thí nghiệm này đã tối thiểu 3 lần lặp lại với các mẫu và 2 nồng độ primer (20γM/L và 10γM/L), các kết quả cho ra các band có kích thƣớc chênh lệch bp so với hình 3.10b nhƣng không đáng kể. Với nỗ lực tối ƣu hóa, chúng tôi đã thử bộ KIT PCR để khuếch đại đoạn gen COI nhƣng kết quả cho ra tƣơng tự. Mặc dù, chúng tôi vẫn có thể sử dụng phƣơng pháp cắt gel thu DNA
32
mục tiêu để giải trình tự, nhƣng phƣơng pháp này vƣợt ngoài kinh phí nên việc lựa chọn marker tiếp theo đƣợc ƣu tiên hơn.
Đối với chỉ thị phân tử COI-5P, mẫu DNA rong đƣợc chạy PCR với gradient nhiệt độ bắt cặp lần lƣợt là 49oC, 50oC, 51oC, 52oC. Kết quả cho thấy độ sáng của band đều và rõ ở mọi nhiệt độ và không xuất hiện band không đặc hiệu ở hình 3.10b. Trong bài báo cáo, nhiệt độ bắt cặp 51o
C với chu trình nhiệt đƣợc trình bày ở bảng 2.4.
COI-5P đã đƣợc chứng minh là marker phù hợp để định danh rong đỏ và cả rong nâu [33]. Bên cạnh đó, 51oC là nhiệt độ bắt cặp trong bài nghiên cứu tƣơng tự nhiệt độ bắt cặp ở các nghiên cứu khác nhƣ 51,3oC [34]; 50oC ở nghiên cứu Robba & ctv (2006) [17]. Nhƣ phần tổng quan đã nêu, vùng trình tự COI-5P có độ dài dao động từ 600 - 800bp, điều này là hoàn toàn phù hợp với cặp mồi chúng tôi đã lựa chọn. Ngoài ra, cặp mồi cũng đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu của Montecinos &Alejandro (2016) và Harith & ctv (2019) để phân cấp loài G. blodgettii cùng chi với G. tenuistipitata. Vì vậy, cặp mồi GazF2, GazR2 với nhiệt độ bắt cặp 52oC đƣợc kết luận là phù hợp khuếch đại gen marker COI-5P để định danh loài trong chi Gracilaria Greville.
3.3 CÂY PHÁT SINH CHỦNG LOÀI