Hình 1.2 Nguyên tcc cCự'nh enzyme bWng kY thu t CLEAs
Trái ngư c v i kY thu t CLECs yêu c,u enzyme cC ự'nh ph*i 7 d ng tinh
khi t, CLEAs có tha ự&ng cC ự'nh hai hay nhi`u enzyme v i nhau houc có l n các protein t p. Ngoài ra, ựa gia tăng ho t tắnh hay tắnh ch n l c l p thaựCi v i cơ ch t cho enzyme cCự'nh thì trong quá trình cCự'nh ựư c b{ sung v i các ch t b{ tr , có
T o liên k t chéo
vai trò b*o v+ hay bi n ự{i c u trúc enzyme. Vắ df CLEAs lipase cC ự'nh v i các ch t b{ tr thư ng ựư c b{ sung như BSA, Tween 80, Triton X-100Ầ[5]
So v i các phương pháp cC ự'nh enzyme trư c ựây thì phương pháp CLEAs có ưu ựiam quá trình cC ự'nh ựơn gi*n và không yêu c,u enzyme có ự tinh khi t cao. Trên th_c t , CLEAs là s_ k t h p c-a quá trình tinh s ch và cC ự'nh enzyme, có tha th_c hi+n cCự'nh tr_c ti p tS d'ch sau lên men ựã lo i sinh khCi. đi`u này có l i ắch là làm gi*m th i gian s*n xu t và h giá thành enzyme. Áp dfng v i nhi`u lo i enzyme khác nhau, d/ dàng trong vi+c thu h&i và tái s8 dfng enzyme cC ự'nh. Nh vào liên k t chéo gi9a các enzyme sẶ h n ch ựư c s_ t_ phân c-a enzyme và tăng s_ {n ự'nh c-a enzyme khi ti p xúc v i nhi+t hay trong dung môi h9u cơ. V i CLEAs khi cCự'nh không che m t enzyme mà có tha là m t ph0c h+ nhi`u enzyme
ựa xúc tác trong các chuki ph*n 0ng [4][5].
1.2.2. Tắnh chAt CLEAs
Kắch thư c là tắnh ch t quan tr ng c-a b t kỳ s*n phpm enzyme cC ự'nh khi
0ng dfng vào trong s*n xu t công nghi+p, tác ự ng tr_c ti p lên s_ linh ự ng và thu
h&i ch t xúc tác. Các enzyme cCự'nh theo kY thu t CLEAs có kắch thư c ph{ bi n
tS 5-50Ớm, do ựó khi s8 dfng và thu h&i CLEAs thì phù h p v i quy trình s*n xu t theo mỔ. Trái ngư c v i các enzyme cCự'nh trên ch t mang rcn, enzyme cCự'nh có tha b' m t ho t tắnh hoàn toàn do hi+n tư ng khu ch tán gi i h n. Tuy nhiên, CLEAs có c u trúc siêu lk, nên sẶ tránh ựư c hi+n tư ng khu ch tán gi i h n khi s8
dfng trong các ph*n 0ng chuyan hóa sinh h c như t{ng h p h p ch t h9u cơ. Ngư c l i, trong các thắ nghi+m xác ự'nh ho t tắnh enzyme theo phương pháp quang ph{ (OD), thì tCc ự ph*n 0ng x*y ra nhanh. Vì v y, khi xác ự'nh ho t tắnh enzyme cCự'nh theo kY thu t CLEAs c,n th n tr ng vì có tha k t lu n sai l,m v` ho t tắnh c-a các CLEAs enzyme th p cho các ph*n 0ng sinh h c th_c t [4].
TCc ự khu ch tán thì b' *nh hư7ng b7i kắch thư c CLEAs, quy t ự'nh bWng tỤ
sC tác nhân t o liên k t chéo trên enzyme [6]. Nhưng kắch thư c tCi ưu c-a các CLEAs enzymel i thư ng có kắch thư c nhd hơn kắch thư c c-a lk l c. Do ựó, khi
cC ự'nh c,n ph*i hòa h p gi9a ho t tắnh và kắch thư c khCi enzyme cC ự'nh. Kắch thư c CLEAs b' *nh hư7ng ch- y u b7i tỤ sC tác nhân liên k t v i enzyme, có tha ựư c tăng lên. B7i vì quá trình t o liên k t chéo gi9a enzyme và tác nhân t o liên
k t không dSng l i khi ph*n 0ng t o liên k t k t thúc. Tuy nhiên, 7 ựi`u ki+n ho t
ự ng liên tfc trong thi t b' d ng tháp ự+m yêu c,u c,n có kắch thư c l n ựa tránh gi*m áp su t l n trên toàn c t. M t gi*i pháp, nhCt CLEAs enzyme trong polyvinyl alcohol (ựư c g i là Lentikats). Muc dù làm gi*m m t ph,n ho t tắnh CLEAs enzyme nhưng mang l i ự b`n cơ h c và có kắch thư c l n hơn [4][7]. Tuy nhiên, v n ự` này ựư c khcc phfc khi s8 dfng thi t b' d ng tháp t,ng sôi, các CLEAs enzyme có kắch thư c nhd, ho t tắnh cao, c,n ph*i có khCi lư ng riêng ự- l n ựa
chúng không b' th{i bay ra khdi c t ph*n 0ng. G,n ựây, phát trian kY thu t CLEAs tS tắnh thắch h p v i thi t b' kiam soát tS tắnh (magnetically stabilized bed). Bên c nh các ưu ựiam như kh* năng thu h&i, kiam soát, tái s8 dfng, cũng nhưự b`n, tỤ
tr ng , ự c0ng c-a khCi CLEAs, ngoài ra có tha thay ự{i kắch thư c và tắnh k|
nư c bWng cách thay ự{i thành ph,n silica-CLEAs [4].
1.2.3. CAu trúc CLEAs
Các c u trúc CLEAs enzyme ựư c nghiên c0u dư i kắnh hian vi ựi+n t8, c u trúc CLEAs ch- y u 7 hai d ng. D ng CLEAs ựư c hình thành tS enzyme Candida antarctica lipase B (hình1.3), ắt b' glycosyl hóa và tắnh k| nư c cao, ựư ng kắnh khCi kho*ng 1 . Khi th_c hi+n CLEAs v i enzyme CaLB (5x5x5nm) thì mki khCi CLEAs ch0a tCi ựa 8*106 phân t8 enzyme. V i các khCi k t tf tS enzyme d/ b'
glycosyl hóa trên b` mut hay b` mut ưa nư c l n thì kắch thư c khCi CLEAs sẶ nhd
hơn v i ựư ng kắnh kho*ng 0.1 Ớm, là d ng th0 2 (hình 1.4) ch0a tCi ựa kho*ng 8*103 phân t8 enzyme. Vắ df như enzyme Candida rugosa lipase và Prunus amygdalus R-oxynitrilase. Các enzyme này có d/ glycosyl hóa nên b` mut enzyme có tắnh ưa nư c cao hơn. Muc dù d ng 1 có sC lư ng phân t8 enzyme l n hơn hàng ngàn l,n so v i d ng 2 nhưng khi 7 ựi`u ki+n tCi ưu c* 2 d ng CLEAs góp ph,n tăng ho t tắnh t_ nhiên c-a enzyme. B7i vì, m t ự phân t8 CLEAs enzyme cao hơn so v i protein t_ do trong dung d'ch và s_ khu ch tán h n ch ựuc bi+t trong ph*n
0ng x*y ra nhanh [8]. Trong quá trình thu nh n enzyme cC ự'nh bWng kY thu t CLEAs x*y ra hi+n tư ng k t khCi gi9a các CLEAs enzyme có tha k t thành các khCi l n (hình 1.5) có tha tác ự ng ự n s_ linh ự ng c-a khCi CLEAs. Kắch thư c c-a các khCi này có thaự t ự n 100Ớm, có tha nhìn th y bWng mct thư ng. SC lư ng CLEAs trong mki khCi cũng không ự&ng ự`u tS m t vài ự n vài trăm ngàn. Khi thu nh n bWng phương pháp ly tâm ựa tách CLEAs làm tăng hi+n tư ng k t khCi CLEAs [8].
Hình 1.3 C u trúc khCi CLEAs Candida Antarctica lipase A/B
Hình 1.5 KhCi CLEAs Candida Antarctica lipase A/B trong nư c
1.2.4. đ mn ự<nh CLEAs enzyme
M t trong nh9ng lý do chắnh ựa cCự'nh enzyme ựa góp ph,n làm tăng ựáng ka
s_ {n ự'nh c-a enzyme trư c tác ự ng c-a nhi+t cũng như dung môi h9u cơ. BWng cách gi*m s_ bi n ự{i c u trúc, phân ly các tiau ựơn v' houc các tương tác y u b'
m t, ựa b*o v+ c u trúc b c bCn c,n thi t cho ho t tắnh enzyme. KY thu t CLEAs là kY thu t cC ự'nh enzyme r t có hi+u qu* trong vi+c {n ự'nh c u trúc b c bCn c-a enzyme 7 nhi+t ự cao. Hình 1.6, thắ nghi+m c-a Sorgedrager và c ng s_ kh*o sát s_ {n ự'nh nhi+t c-a enzyme papain (protease tS Carica papaya). S_ {n ự'nh c-a enzyme CLEAs papain, trong th-y phân N-Bz-Arg-OEt 7 pH 7 và 50ồC, có s_ {n
ự'nh cao hơn so v i enzyme papain t_ do [4].
M t ựuc tắnh chung c-a các enzyme ựa tiau ựơn v' có kh* năng ch'u nhi+t y u khi 7 ngoài t bào do các tiau ựơn v' d/ b' phân ly mà d n ự n m t ho t tắnh. Vắ df, enzyme Nitrile hydratase (NHase) thu c nhóm enzyme quan tr ng 0ng dfng trong công nghi+p có ựuc trưng có s_ {n ự'nh kém khi 7 ngoài t bào [9]. Do ựó, các s*n phpm chuyan hóa trung gian c-a enzyme NHase như acrylamide và nicotinamide tS
hydratase thu nh n tS vi khupn ưa ki`m Nitriliruptorakaliphilus bWng kY thu t CLEAs ựư c minh ch0ng có tác ự ng tăng s_ {n ự'nh trong quá trình b*o qu*n so v i enzyme t_ do (hình 1.7) [4][10].
Papain (protease tS C. papaya) ựư c -7 500C và pH 7
Ho t tắnh gi9 l i kh*o trên ph*n 0ng th-y phân N-Bz-Arg-OEt Hình 1.6 S_ b`n nhi+t c-a CLEAs papain
Hình 1. 7 S_{n ự'nh c-a enzyme NHase khi b*o qu*n 7 210C
% Ho t tắnh Enzyme t_ do CLEAs