Thẩm định phương pháp là ựs khẳng định b ng vi c kiằ ệ ểm tra và cung cấp b ng ằ chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầ đặu t ra. K t qu c a thế ả ủ ẩm định phương pháp có thể được s dử ụng để đánh giá chất lượng, độ tin c y c a k t qu ậ ủ ế ả phân tích. Thẩm định phương pháp phân tích là m t phộ ần không thể thiếu nếu muốn có mộ ết k t qu ả phân tích đáng tin cậ [2]. y
Để đánh giá khả năng sử dụng của phương pháp thử cần dựa vào các thông số sau:
1.4.1 Độ thích hợp h ệ thống
Thông thường các phương pháp phân tích sắc ký cần có sự đánh giá để đả m b o h ả ệ thống phù hợp để phân tích. Đánh giá sự phù hợp c a h ủ ệ thống là các phép thử để ch ng minh r ng h ốứ ằ ệ th ng hoạt động đúng theo mục đích sử ụ d ng. Cần đánh giá hàng ngày tùy thuộc vào độ ổn định c a h th ng ho c s lư ng mủ ệ ố ặ ố ợ ẫu phân tích hàng ngày.
Phép thử đánh giá sự phù hợp c a h th ng củ ệ ố ủa các phương pháp sắc ký được quy định theo nhi u t ch c (USP, USFDA) ề ổ ứ như sau:
- Độ ch m c a thụ ủ ời gian lưu, diện tích píc sắc ký: Tiêm trực ti p dung d ch ế ị chuẩn nhi u l n l p lề ầ ặ ại vào hệ ố th ng sắc ký và xác định độ ệ l ch chuẩn tương đối (RSD). S lố ần bơm tối thi u 5 l n ph i cho RSD nh ể ầ ả ỏ hơn 2%. ếN u RSD lớn hơn 2% cần s d ng 6 ử ụ điểm.
- Độ phân giải gi a hai ch t ữ ấ - H s ệ ố kéo đuôi
- Các thông số khác: như độ trôi đường n n, nhiề ễu đường n n (khi gi i h n ề ớ ạ phát hiện đóng vai trò quan trọng trong phương pháp)
1.4.2 Tính chọ ọn l c/đ c hiệặ u
- Tính đặc hiệu [2]: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất....
- Tính chọn lọc: ếN u ch t cấ ần xác định phân bi t rõ v i các ch t khác thì ệ ớ ấ phương pháp phân tích có tính chọn lọc.
1.4.3 Xây dựng đường chu n ẩ
Dựa vào khoảng tuyến tính trong tài liệu tham kh o [2] ả và điều kiện thưc tế xây dựng đường chuẩn để tìm giá trị độ ốc của đườ d ng chuẩn trong công thức tính giá trị LOD và LOQ.
Hình Đư8: ờng chu n d ng y=a.x+b ẩ ạ
Xây dựng đường chuẩn:
Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn v i nớ ồng độ khác nhau (ít nhất 6 nồng độ), trong kho ng tuyả ến tính ước lượng, m i nỗ ồng độ làm 3 lần. V ẽ đường cong ph ụ thuộc giữa tín hiệu đo phụ thuộc vào nồng độ và biể ễn dướ di i dạng: y = ax + b
Trong đó: a là giá trị slope (độ ố d c)
intercept (h s n) b là giá trị ệ ố chặ và hệ ố tương quan: s ) Y y ( ) X x ( ) Y y )( X x ( R i 2 i i i
Nếu 0,995 < R ≤ 1 : Có tương quan tuyến tính rõ rệt.
y = a.x +b 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 500 1000 1500 2000 2500 D iệ n tí ch ( m A U *s ) Nồng độ (ng/g) Đường chuẩn
1.4.4 Độ ặ ại và độ l p l thu h i ồ
Độ ặ ạ l p l i: tiến hành phân tích các ồng độ khác nhau (trung bình, thấ n p, cao) trong khoảng làm việc, m i nỗ ồng độ làm lặ ạp l i 6 lần. Tính độ ệ l ch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD theo các công thức sau [2]:
1 n x x SD 2 i % SD 100 RSD x Trong đó: l ch chu n SD: độ ệ ẩ n: s lố ần thí nghiệm
xi: Giá trị tính được của lần th nghiử ệm thứ “i”
x: Giá trị trung bình của các lần th nghi m ử ệ l ch chu i
RSD%: Độ ệ ẩn tương đố
Độ thu hồi: Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu 6 lần bằng phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau đây:
- Đối với mẫu thử:
100 C C C % R c m c m
- Đối với mẫu trắng:
100 C C % R c tt
Trong đó: R%: Độ thu hồi, %
Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Thêm chất chuẩn ở 3 mức nồng độ là mức thấp, trung bình và cao trong khoảng nồng độ làm việc 0,5 lần, 1 lần và 2 lần giới hạn cho phép Sau khi đánh giá . độ thu hồi, so sánh kết quả với các giá trị cho bởi trong bảng . Độ thu hồi ở các 4 nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau.
B ng 4ả : Độ thu hồi và độ ệch chuẩn tương đối ở các khoả l ng nồng độ khác nhau Hàm lượng % T l ỉ ệ chất Đơn vị Độ thu h i % ồ RSD % Hàm lượng % T l ỉ ệ chất Đơn vị Độ thu h i % ồ RSD %
100 1 100% 98 102 – 1,3 10 10-1 10% 98 102 – 2,8 1 10-2 1% 97 103 – 2,7 0,1 10-3 0,1% 95 - 105 3,7 10-2 10-4 100 ppm 93 - 107 5,3 10-3 10-5 10 ppm 80 - 110 7,3 10-4 10-6 1ppm 80 - 110 11 10-5 10-7 100 ppb 80 - 110 15 10-6 10-8 10 ppb 60 - 115 21 10-7 10-9 1 ppb 40 - 120 30
1.4.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giớ ạn phát hiệi h n (LOD) là nồng độ mà tại đó giá trị xác định đượ ớn hơn c l độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồ g độn th p nh t c a chấ ấ ủ ất phân
tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối v i ớ phương pháp định lượng) [2].
Cách xác định (dựa trên đường chu n) ẩ
LOD có thể được xác định dựa vào độ ố d c của đường chuẩn và độ ệ l ch chu n ẩ của tín hiệu đo. a SD 3 , 3 LOD
Trong đó: SD: Độ ệ l ch chu n cẩ ủa tín hiệu d ng chu n a: Độ ốc của đườ ẩ
SD đượ tính bằng cách phân tích lặ ạc p l i 10 l n m u trầ ẫ ắng thêm chuẩ ở ần g n nồng độ LOD ước lư ngợ .
Giới h n định lượng (LOQ) ạ là nồng độ ố t i thi u c a m t chể ủ ộ ất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết qu ả có độ ch m ụ mong mu n. ố Cách tính: a SD 10 LOQ 1.4.6 Độ tái lặp
Nguyên tắc: Tiến hành phân tích mẫu vào ngày khác nhau với điề2 u kiện thí nghiệm không thay đổ . Độ tái lặi p của phương pháp được đánh giá thông qua hệ ố s RSD và độ đồ ng nh t thấ ống kê của các kết qu th nghi m c a 2 ả ử ệ ủ ngày thực hi n ệ cũng được đánh giá bằng phương pháp phân tích phương sai 1 yế ố ủu t c a phần m m ề Excel ANOVA SINGLE FACTOR.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vậ ệu và thiế ịt li t b 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu * Mẫu phân tích:
- Mẫu bánh Trung thu t ự làm được nướng 3 l n 180ầ ở oC.
- Mẫu bánh Trung thu mua ngẫu nhiên ở chợ, siêu thị ửa hàng tạp hóa, bán online , c trên mạng.
* M u tr ng: ẫ ắ bánh trung thu trước khi nướng. 2.1.2 Hóa chất và thiế ịt b
* Các hóa chất tinh khi t: ế
- Aetone (tinh khiết dùng cho HPLC) - Methanol (tinh khiết dùng cho HPLC) - Nước cất 2 lần dùng cho phân tích
- Chất chuẩn acrylamide (Sigma Aldrich > 99,0%) * Thiết bị và dụng c : ụ
- H ệ thống sắc ký: Hệ thống Agilent 1260 Inifity II (USA) + Bơm cao áp 1260 Quat Pump (G7111B)
+ Detector 1260 DAD HS (G7117C) + Ph n mầ ềm: OpenLAB software
- Máy Vortex (Model MS3D IKA USA) - Máy ly tâm fancol 50 ml
- Máy ly tâm eppendoft: Eppendoft AG (22331 Hamburg Germany) - Máy siêu âm GT-1620QTS (GTSonic)
- Cân phân tích CPA 224S (Germany) - Ông falcon 50 ml, 15 ml
- Bình định m c ứ - Micropipet
- Xylanh, filter 0,25 μm.
2.2 Nội dung nghiên cứu
Để đánh giá ảnh hưởng c a s lủ ố ần nướng tới hàm lượng AA trong n n mề ẫu bánh Trung thu chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp phân tích định lượng trên thiết b HPLC-DAD ị sau đó thẩm định phương pháp được xây dựng và tiến hành phân tích ẫm u th t. ậ
* Xây dựng phương pháp định lượng
- Khảo sát các điều ki n thiệ ết bị ắ s c ký lỏng: Pha động, tốc đ dòng, ột sắc ký.ộ c - Khảo sát điều ki n x ệ ử lý mẫ : phương pháp chiếu t và dung môi chiết
- Thẩm định quy trình: Độ thích hợp h ệ thống, độ chọ ọ , độ ặ ại và độ n l c l p l thu h i, ồ LOD và LOQ.
* Ứng dụng quy trình trên phân tích mẫu th tậ
- Mẫu bánh tự làm được nướng ở các nhiệ ột đ khác nhau - Mẫu bánh mua ngẫu nhiên
* Đánh giá ảnh hư ng c a s lở ủ ố ần nướng tới hàm lượng acrylamide trong bánh Trung thu.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu:
* Quy trình sản xuất bánh trung thu t ến hành như saui [2, 26]:
Sơ đồ : Quy trình làm bánh Trung thu 8 Quy trình làm bánh:
- Chọn b t ộ làm bánh là loại ột mì trắb ng mịn để có độ ẻ d o - Trộn b t vộ ới nước đường, dầu ăn khu y k ấ ỹ để làm vỏ bánh. - B t sau khi trộ ộn được nhào kỹ, cán mỏng mịn để làm vỏ bánh - Nhồi nhân vào vỏ, đóng vào khuôn có sẵn.
- Nướng bánh 3 lần, m i l n 5 ỗ ầ phút ở 180 oC. Giữa m i lỗ ần nướng, bánh được xịt nước cho ngu i, tộ ạo độ ẩ m cho v ỏ sau đó cho vào nướng ti p. ế
- Bánh nướng xong để nguội tự nhiên * M u mua t cẫ ừ ửa hàng tạp hóa, siêu thị, ch . ợ
M u ẫ được cắ ấ ớp vỏ dày 0,5 cm, xay mịn, đồt l y l ng nhất và đánh mã số ẫ m u. Xử lý mẫu: Vì mẫu có các thành phần béo (dầu) nên trong quá trình xửa lý mẫu phải loại các thành phần này bằng dung môi không phân cực n-hexan. Sau đó acrylamide được chiết bằng hỗn hợp dung môi có khả năng hòa tan tốt và lượng tạp được chiết ra ít nhất. Để quá trình chiết có hiệu quả cao nh sử dụng phương pháp ất chiết lỏng lỏng và để lạnh 0-5 oC trong 30 phút để loại bỏ hoàn toàn lớp n-hexan.
Dịch chiết đem cô khô, hòa tan lại bằng nước, lọc qua màng lọc 0,2 μ5 m và tiêm vào hệ sắc ký.
2.3.2 Phương pháp phân tích b ng thi t b sằ ế ị ắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò DAD Acrylamide được xác định với hệ sắc ký bao gồm :
- Hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent - Đầu dò DAD
- Cột : Eclipse Plus C18 Agilent 5 μm, 250 mm x 4,6 mm - Pha động: Nước - Thể tích tiêm : 20 l μ - Tốc độ dòng: 0,6 ml/ phút - Nhiệt độ cột 30oC 2.3.3 Thẩm địnhphương pháp 2.3.3.1 Độ thích h p c a h th ng ợ ủ ệ ố
Chuẩn b dung d ch chuị ị ẩn có nồng độ 1 ppm t dung d ch chu n g c 20 ppm ừ ị ẩ ố b ng ằ cách pha loãng 20 lầ trongn dung d ch chi t m u tr ng. ị ế ẫ ắ Tiến hành tiêm lặ ại p l dung d ch chu n nị ẩ ồng độ 1 ppm 6 l n bầ ằng chương trình sắc ký đã tối ưu. Đánh giá độ thích hợp h thệ ống thông qua độ ệ l ch chuẩn tương đối (RSD). N u RSD nh ế ỏ hơn 2% h ệ thống phù hợp để phân tích.
2.3.3.2 Tính chọ ọn l c
Sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu (co-chromatography). Sau khi chuẩn bị mẫu trắng và phân tích mẫu trắng trên thiết bị sắc ký thu được các peak sắc ký, ta thêm chuẩn vào mẫu trắng và phân tích mẫu này. So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu/chọn lọc.
2.3.3.3 Xây dựng đường chu n ẩ
T dung d ch chu n gừ ị ẩ ốc 20 ppm trong nước tiến hành pha loãng thành các nồng độ 0,2 ; 0,4 ; 0,8 ; 1,0 ; 1,6 ; 2,0 ppm bằng dung d ch chi t m u tr ng ị ế ẫ ắ như sau :
B ng 5ả : Cách pha các dung dịch chu n ẩ Tên dung dịch Nồng độ (ppm) Cách pha
Chuẩn g c ố 20
Chuản s 1 ố 2,0 1 ml chu n 20 ppm +9 ml dd chi t ẩ ế Chuẩn s 2 ố 1,6 2 ml chu n 20 ppm + 23 ml dd chi t ẩ ế Chuẩn s 3 ố 1,0 1 ml chu n 20 ppm + 19 ml dd chi t ẩ ế Chuẩn s 4 ố 0,8 1 ml chu n 20 ppm + 24 ml dd chi t ẩ ế Chuẩn s 5 ố 0,4 1 ml chu n 20 ppm + 49 ml dd chi t ẩ ế Chuẩn s 6 ố 0,2 1 ml chu n 2 ppm + 9 ml dd chi t ẩ ế Tiến hành phân tích bằng chương trình sắc ký đã lựa ch n, t k t qu thu ọ ừ ế ả dược v ẽ đường cong tín hiệu đo (trục tung y) ph thuụ ộc vào nồng độ (trục x). Chỉ tiêu của
m t ộ đường chuẩn đạt yêu cầu là hệ ố tương quan hồ s i quy (Coefficient of correlation) R phải đạt theo yêu cầu sau: 0,995 ≤ R ≤ 1 Hay 0,99 ≤ R2≤ 1.
2.3.3.4 Độ ặ ại và độ l p l thu h i ồ
Để xác định độ ặ l p lại và độ thu h i bồ ằng cách phân tích lặp l i 6 lạ ần các dung dịch có nồng độ 0,4 ppm; 1,0 ppm và 2,0 ppm. Tính toán độ ệ l ch chuẩn tương đối và độ thu h i ồ sau đó so sánh với tiêu chuẩn trong b ng 4. ả
2.3.3.5 Giới hạn phát hiện và giớ ạn định lượi h ng
Chuẩn b ị 6 điểm chuẩn có nồng độ 0,2; 0,4; 0,8, 1,0; 1,6; 2,0 ppm. Xây dựng đường tuyến tính thể hi n m i quan h gi a nệ ố ệ ữ ồng độ AA và diện tích peak. Xác định h s ệ ốa.
Chuẩn b 10 dung d ch m u ị ị ẫ trắng thêm chuẩ ở ần g n nồng độ LOD ước lượng. Tiến hành phân tích bằng chương trình sắc ký đã tối ưu. Tính toán độ ệ l ch chu n ẩ của tín hiệu đo SD.
LOD, LOQ xác định bằng công thức:
a SD 3 , 3 LOD , LOQ 10 SD a
Trong đó: SD: Độ ệ l ch chu n cẩ ủa tín hiệu a : Độ ố d c của đường chu n ẩ
2.3.3.6 Độ tái lặp phòng thí nghiệm
Chuẩn b dung dị ịch có nồng độ 1 ppm pha trong dung d ch chi t m u tr ng. ị ế ẫ ắ Tiến hành phân tích lặ ạp l i 6 lần vào hai ngày khác nhau. Để đánh ự đồs ng nh t k t ấ ế qu ả thử nghiệm giữa hai ngày s dung ANOVA Single Factor. ử
Chương 3: ẾK T QUẢ TH C NGHI M Ự Ệ
3.1 K t qu ế ả thực nghi m ệ
3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng 3.1.1.1 Khảo sát điều ki n sệ ắc ký 3.1.1.1 Khảo sát điều ki n sệ ắc ký
a. L a chự ọn bước sóng
Dựa trên các tài liệu đã được công bố và sắc ký đồ acrylamide nồng độ 10 g/μ mL khảo sát các bước sóng dưới đây chúng tôi chọn bước sóng 202 nm do có tín hiệu l n nh ớ ất.
Hình 10: Sắc ký dồ AA 10 ppm ở các bước sóng 202, 210, 226 nm B ng 6ả : Kết quả chọn bước sóng
Bước sóng (nm) Diện tích peak (mAU* s)
202 2530,667
210 1492,335
226 471,117
b. Lựa chọn pha động
Qua tham khảo các tài liệu [5] chúng tôi tiến hành chọn 2 pha động như sau để phân tích:
Hình 11: Sắc ký đồ của pha động Nước: MeOH = 96: 4 Ưu điểm: r a gi i đư c nhiử ả ợ ều thành phần ra kh i c t. Peak ch t ra s m. ỏ ộ ấ ớ
Nhược điểm: Do có nhiều peak tạp nên có thể ị b ch ng peak dồ ẫn đến sai l ch k t ệ ế