2.1.1 Đối tượng nghiên cứu * Mẫu phân tích:
- Mẫu bánh Trung thu t ự làm được nướng 3 l n 180ầ ở oC.
- Mẫu bánh Trung thu mua ngẫu nhiên ở chợ, siêu thị ửa hàng tạp hóa, bán online , c trên mạng.
* M u tr ng: ẫ ắ bánh trung thu trước khi nướng. 2.1.2 Hóa chất và thiế ịt b
* Các hóa chất tinh khi t: ế
- Aetone (tinh khiết dùng cho HPLC) - Methanol (tinh khiết dùng cho HPLC) - Nước cất 2 lần dùng cho phân tích
- Chất chuẩn acrylamide (Sigma Aldrich > 99,0%) * Thiết bị và dụng c : ụ
- H ệ thống sắc ký: Hệ thống Agilent 1260 Inifity II (USA) + Bơm cao áp 1260 Quat Pump (G7111B)
+ Detector 1260 DAD HS (G7117C) + Ph n mầ ềm: OpenLAB software
- Máy Vortex (Model MS3D IKA USA) - Máy ly tâm fancol 50 ml
- Máy ly tâm eppendoft: Eppendoft AG (22331 Hamburg Germany) - Máy siêu âm GT-1620QTS (GTSonic)
- Cân phân tích CPA 224S (Germany) - Ông falcon 50 ml, 15 ml
- Bình định m c ứ - Micropipet
- Xylanh, filter 0,25 μm.
2.2 Nội dung nghiên cứu
Để đánh giá ảnh hưởng c a s lủ ố ần nướng tới hàm lượng AA trong n n mề ẫu bánh Trung thu chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp phân tích định lượng trên thiết b HPLC-DAD ị sau đó thẩm định phương pháp được xây dựng và tiến hành phân tích ẫm u th t. ậ
* Xây dựng phương pháp định lượng
- Khảo sát các điều ki n thiệ ết bị ắ s c ký lỏng: Pha động, tốc đ dòng, ột sắc ký.ộ c - Khảo sát điều ki n x ệ ử lý mẫ : phương pháp chiếu t và dung môi chiết
- Thẩm định quy trình: Độ thích hợp h ệ thống, độ chọ ọ , độ ặ ại và độ n l c l p l thu h i, ồ LOD và LOQ.
* Ứng dụng quy trình trên phân tích mẫu th tậ
- Mẫu bánh tự làm được nướng ở các nhiệ ột đ khác nhau - Mẫu bánh mua ngẫu nhiên
* Đánh giá ảnh hư ng c a s lở ủ ố ần nướng tới hàm lượng acrylamide trong bánh Trung thu.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu:
* Quy trình sản xuất bánh trung thu t ến hành như saui [2, 26]:
Sơ đồ : Quy trình làm bánh Trung thu 8 Quy trình làm bánh:
- Chọn b t ộ làm bánh là loại ột mì trắb ng mịn để có độ ẻ d o - Trộn b t vộ ới nước đường, dầu ăn khu y k ấ ỹ để làm vỏ bánh. - B t sau khi trộ ộn được nhào kỹ, cán mỏng mịn để làm vỏ bánh - Nhồi nhân vào vỏ, đóng vào khuôn có sẵn.
- Nướng bánh 3 lần, m i l n 5 ỗ ầ phút ở 180 oC. Giữa m i lỗ ần nướng, bánh được xịt nước cho ngu i, tộ ạo độ ẩ m cho v ỏ sau đó cho vào nướng ti p. ế
- Bánh nướng xong để nguội tự nhiên * M u mua t cẫ ừ ửa hàng tạp hóa, siêu thị, ch . ợ
M u ẫ được cắ ấ ớp vỏ dày 0,5 cm, xay mịn, đồt l y l ng nhất và đánh mã số ẫ m u. Xử lý mẫu: Vì mẫu có các thành phần béo (dầu) nên trong quá trình xửa lý mẫu phải loại các thành phần này bằng dung môi không phân cực n-hexan. Sau đó acrylamide được chiết bằng hỗn hợp dung môi có khả năng hòa tan tốt và lượng tạp được chiết ra ít nhất. Để quá trình chiết có hiệu quả cao nh sử dụng phương pháp ất chiết lỏng lỏng và để lạnh 0-5 oC trong 30 phút để loại bỏ hoàn toàn lớp n-hexan.
Dịch chiết đem cô khô, hòa tan lại bằng nước, lọc qua màng lọc 0,2 μ5 m và tiêm vào hệ sắc ký.
2.3.2 Phương pháp phân tích b ng thi t b sằ ế ị ắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò DAD Acrylamide được xác định với hệ sắc ký bao gồm :
- Hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent - Đầu dò DAD
- Cột : Eclipse Plus C18 Agilent 5 μm, 250 mm x 4,6 mm - Pha động: Nước - Thể tích tiêm : 20 l μ - Tốc độ dòng: 0,6 ml/ phút - Nhiệt độ cột 30oC 2.3.3 Thẩm địnhphương pháp 2.3.3.1 Độ thích h p c a h th ng ợ ủ ệ ố
Chuẩn b dung d ch chuị ị ẩn có nồng độ 1 ppm t dung d ch chu n g c 20 ppm ừ ị ẩ ố b ng ằ cách pha loãng 20 lầ trongn dung d ch chi t m u tr ng. ị ế ẫ ắ Tiến hành tiêm lặ ại p l dung d ch chu n nị ẩ ồng độ 1 ppm 6 l n bầ ằng chương trình sắc ký đã tối ưu. Đánh giá độ thích hợp h thệ ống thông qua độ ệ l ch chuẩn tương đối (RSD). N u RSD nh ế ỏ hơn 2% h ệ thống phù hợp để phân tích.
2.3.3.2 Tính chọ ọn l c
Sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu (co-chromatography). Sau khi chuẩn bị mẫu trắng và phân tích mẫu trắng trên thiết bị sắc ký thu được các peak sắc ký, ta thêm chuẩn vào mẫu trắng và phân tích mẫu này. So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu/chọn lọc.
2.3.3.3 Xây dựng đường chu n ẩ
T dung d ch chu n gừ ị ẩ ốc 20 ppm trong nước tiến hành pha loãng thành các nồng độ 0,2 ; 0,4 ; 0,8 ; 1,0 ; 1,6 ; 2,0 ppm bằng dung d ch chi t m u tr ng ị ế ẫ ắ như sau :
B ng 5ả : Cách pha các dung dịch chu n ẩ Tên dung dịch Nồng độ (ppm) Cách pha
Chuẩn g c ố 20
Chuản s 1 ố 2,0 1 ml chu n 20 ppm +9 ml dd chi t ẩ ế Chuẩn s 2 ố 1,6 2 ml chu n 20 ppm + 23 ml dd chi t ẩ ế Chuẩn s 3 ố 1,0 1 ml chu n 20 ppm + 19 ml dd chi t ẩ ế Chuẩn s 4 ố 0,8 1 ml chu n 20 ppm + 24 ml dd chi t ẩ ế Chuẩn s 5 ố 0,4 1 ml chu n 20 ppm + 49 ml dd chi t ẩ ế Chuẩn s 6 ố 0,2 1 ml chu n 2 ppm + 9 ml dd chi t ẩ ế Tiến hành phân tích bằng chương trình sắc ký đã lựa ch n, t k t qu thu ọ ừ ế ả dược v ẽ đường cong tín hiệu đo (trục tung y) ph thuụ ộc vào nồng độ (trục x). Chỉ tiêu của
m t ộ đường chuẩn đạt yêu cầu là hệ ố tương quan hồ s i quy (Coefficient of correlation) R phải đạt theo yêu cầu sau: 0,995 ≤ R ≤ 1 Hay 0,99 ≤ R2≤ 1.
2.3.3.4 Độ ặ ại và độ l p l thu h i ồ
Để xác định độ ặ l p lại và độ thu h i bồ ằng cách phân tích lặp l i 6 lạ ần các dung dịch có nồng độ 0,4 ppm; 1,0 ppm và 2,0 ppm. Tính toán độ ệ l ch chuẩn tương đối và độ thu h i ồ sau đó so sánh với tiêu chuẩn trong b ng 4. ả
2.3.3.5 Giới hạn phát hiện và giớ ạn định lượi h ng
Chuẩn b ị 6 điểm chuẩn có nồng độ 0,2; 0,4; 0,8, 1,0; 1,6; 2,0 ppm. Xây dựng đường tuyến tính thể hi n m i quan h gi a nệ ố ệ ữ ồng độ AA và diện tích peak. Xác định h s ệ ốa.
Chuẩn b 10 dung d ch m u ị ị ẫ trắng thêm chuẩ ở ần g n nồng độ LOD ước lượng. Tiến hành phân tích bằng chương trình sắc ký đã tối ưu. Tính toán độ ệ l ch chu n ẩ của tín hiệu đo SD.
LOD, LOQ xác định bằng công thức:
a SD 3 , 3 LOD , LOQ 10 SD a
Trong đó: SD: Độ ệ l ch chu n cẩ ủa tín hiệu a : Độ ố d c của đường chu n ẩ
2.3.3.6 Độ tái lặp phòng thí nghiệm
Chuẩn b dung dị ịch có nồng độ 1 ppm pha trong dung d ch chi t m u tr ng. ị ế ẫ ắ Tiến hành phân tích lặ ạp l i 6 lần vào hai ngày khác nhau. Để đánh ự đồs ng nh t k t ấ ế qu ả thử nghiệm giữa hai ngày s dung ANOVA Single Factor. ử
Chương 3: ẾK T QUẢ TH C NGHI M Ự Ệ
3.1 K t qu ế ả thực nghi m ệ
3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng 3.1.1.1 Khảo sát điều ki n sệ ắc ký 3.1.1.1 Khảo sát điều ki n sệ ắc ký
a. L a chự ọn bước sóng
Dựa trên các tài liệu đã được công bố và sắc ký đồ acrylamide nồng độ 10 g/μ mL khảo sát các bước sóng dưới đây chúng tôi chọn bước sóng 202 nm do có tín hiệu l n nh ớ ất.
Hình 10: Sắc ký dồ AA 10 ppm ở các bước sóng 202, 210, 226 nm B ng 6ả : Kết quả chọn bước sóng
Bước sóng (nm) Diện tích peak (mAU* s)
202 2530,667
210 1492,335
226 471,117
b. Lựa chọn pha động
Qua tham khảo các tài liệu [5] chúng tôi tiến hành chọn 2 pha động như sau để phân tích:
Hình 11: Sắc ký đồ của pha động Nước: MeOH = 96: 4 Ưu điểm: r a gi i đư c nhiử ả ợ ều thành phần ra kh i c t. Peak ch t ra s m. ỏ ộ ấ ớ
Nhược điểm: Do có nhiều peak tạp nên có thể ị b ch ng peak dồ ẫn đến sai l ch k t ệ ế qu ả phân tích.
Pha động 2: Nước cất 2 l n ầ
Hình 12: Sắc ký đồ với pha động nước Ưu điểm: R ti n, sẻ ề ẵn có. Peak có hình dạng cân đối.
Nhược điểm: Ch r a giỉ ử ải được các chất phân cực đến trung bình ra khỏ ột nên i c gây nhiễm b n c t. ẩ ộ
Do pha động nước sẵn có, rẻ ền nên c úng tôi chọn nước là pha động cho phân ti h tích acrylamide. Chương trình rửa cột đề xuất sau quá trình chạy mẫu như sau: 50% MeOH 50% H2O 1ml/ phút, 60 phút.
c. L a chự ọn c t s c ký ộ ắ
Dựa vào điều ki n th c t cệ ự ế ủa phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành khảo sát trên 2 c t Cộ : 8 InertSustain và Eclips plus C18 khi cùng phân tích mẫu trắng thêm chuẩn 1 ppm.
Cột 1: 8 InertSustain, 5 μm, 2 C 50 mm x 4,6 mm
Hình 13: Sắc ký đ khi phân tích bằồ ng c t C8 InertSustain ộ Cột 2: Eclipse C18 Plus, 5 m, 250 mm x 4,6 mm μ
Hình 14: Sắc ký đ khi phân tích bằồ ng c t Eclipse Plus C18 ộ Nhận xét: ộC t Eclipse C18 Plus cho peak cân đối hơn, diện tích peak lớn hơn
B ng 7ả : Kết quả ối ưu cột sắc ký t
C t ộ C18 InertSustain Eclipse C18 Plus Diện tích peak (mAU*s) 157,562 194,759
d. Khảo sát tốc đ dòng ộ
Tiến hành phân tích cùng một m u acrylamide tẫ ở ốc độ 0,6 ml/phút, 0,8 ml/phút và 1 ml/phút cho thời gian lưu như sau:
Hình 15: Sắc ký đồ ớ ố v i t c đ dòng 0,6 ml/phútộ
Hình 16: Sắc ký đồ v i tớ ốc đ dòng 0,8 ml/phútộ
Hình 17: Sắc ký đồ v i tớ ốc đ dòng 1 ml/phútộ T sừ ắc ký đồ:
Tốc đ dòngộ Thời gian lưu Diện tích peak 0,6 ml/ phút 7,829 284,544
0,8ml/ phút 6,181 211,759 0,1 ml/ phút 4,780 186,697
Nhận xét: Khi tốc độ dòng tăng, peak acrylamide được r a gi i ra sử ả ớm hơn, nhưng có xu hướng b lị ẫn vào peak tạp c a n n m u. ủ ề ẫ
K t lu n: ch n tế ậ ọ ốc độ dòng 0,6 ml/phut thời gian phân tích 10 phút phù hợp, kh ả năng tách tốt.
e. Điều ki n sệ ắc ký lựa chọn
Qua khảo sát các điều kiện chúng tôi chọn các thông số đã tối ưu như sau: - Cột sắc ký: Eclipse Plus C18 Agilent.
- Bước sóng: 202 nm - Pha động: Nước
- Tốc đ dòngộ : 0,6 ml/min - Thể tích tiêm: 20 l μ - Nhiệ ột đ cột: 30oC
- Thời gian phân tích 10 phút.
3.1.1.2 Xây dựng quy trình chiết m u ẫ
Qua tham khảo tài liệ [5 và hóa chấu ] t thi t b ế ị có sẵn tai phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành hai quy trình chiết m u sau: ẫ
- Dung môi chiết 1:
Chuẩn b ị dung môi acetone ch a 0,01% nước ứ (1)
Chuẩn b ị dung môi n-hexane đã bão hòa aceton ch a 0,01% nước ứ (2)
Cân chính xác 4,00 0,20 gam m u (ph n v ± ẫ ầ ỏ bánh dày 0,5 cm) đã xay mịn cho vào ố ng falcon 50 ml
Thêm 10 ml dung môi (2) vào ống falcon, vortex 5 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút, 5 phút. Để vào ngăn mát tủ ạ l nh 0-5 ở oC trong 30 phút. Lo i b lạ ỏ ớp trên. Chuy n ể dịch chiết sang ống falcon khác Làm 3 ầ. l n với bước này.
Lấy 15 ml dịch chiết, thổi khô ằ b ng khí nitro.
Hòa tan cặn b ng ằ 1ml nước, rung siêu âm, lọc qua màng lọc. Tiêm vào hệ ắ s c ký.
Hình 18: Sắc ký đồ d ch chi t m u trị ế ẫ ắng khi dùng dung môi chiết (1) - Dung môi chiết 2: [16]
Cân chính xác 4,00 0,20 gam mẫu đã nghiền min đượ± c loại béo 2 lần v i 10 ớ ml n-hexan, lắc trong 5 phút Ly tâm 4000 vòng/phút. Loạ ỏ ớp trên.. i b l
M u sau khi ẫ loại béo được làm khô ằng chân không b .
Chiết acrylamide 3 l n b ng 10 ml aceton + 0,01% ầ ằ nước trong b ể siêu âm 40oC 20 phút.
15 ml d ch chi t ị ế đem bay hơi tới khô Hòa tan c n b ng 1ặ ằ ml nước
Lọc qua màng lọc Tiêm vào hệ ắ s c ký
Sơ đồ 10: Quy trình chiế ốt s 2
Nhậ xén t: dựa vào ắc ký đồ phương pháp chiế s 1 s , t ố ít tạp hơn so với phương pháp chiế ốt s 2.
Kết luận: Chọn phương pháp chiế ốt s 1. 3.1.2 Thẩm định phương pháp
3.1.2.1 Tính thích hợp c a h th ng ủ ệ ố
Tiến hành pha dung d ch chu n ị ẩ 1 ppm t dung d ch chu n g c 20 ppm . Tiừ ị ẩ ố ến hành tiêm lặp l i 6 l n vạ ầ ới chương trình ắc ký đã chọ ở trên. Kếs n t qu ả thu được trong bảng sau :
B ng 8ả : Kết quả tính độ thích hợp h ệ thống Lần tiêm Thời gian lưu
(phút) Diện tích peak (mAU*s) 1 8,164 206,2030 2 8,173 207,3630 3 8,179 207,0950 4 8,179 210,8470 5 8,175 207,8100 6 8,166 207,8830 Trung bình 8,173 207,8668 SD 0,0064 1,60 RSD % 0,0784 0,7607
Nhận xét: Bảng tính toán cho thấy độ ệ l ch chuẩn tương đố ủi c a thời gian lưu là 0,0784 %, c a diủ ện tích peak là 0,7607 % đều đạt yêu cầu (<2%). Vì vậy k t luế ận đạt.
3.1.2.2 Tính chọ ọn l c
Tiến hành phân tích sắc ký với m u tr ng, mẫ ắ ẫu thêm chuẩn 0,2 ppm và 1 ppm. Sắc ký đ thu được như sauồ :
Hình 20: Sắc ký đồ m u tr ng ẫ ắ
Hình 21: Sắc ký đồ m u trẫ ắng thêm chuẩn 0,2 ppm
Hình 22: Sắc ký đồ m u trẫ ắng thêm chuẩn 1 m pp
Nhận xét. Trong sắc ký đồ m u tr ng trong kho ng th i gian 7-ẫ ắ ả ờ 9 phút không xu t hi n peak, m u chu n 0,2 ppm ấ ệ ẫ ẩ spike vào mẫu trắng có peak ở 8,2 phút. Khi tăng nồng độ acrylamide lên 1 ppm peak t i 8,2 ạ phút xuất hiện rõ ràng chứng t ỏ phương pháp có tính chọ ọn l c cao.
3.1.2.3 Xây dựng đường chu n ẩ
Tiến hành: từ dung d ch chu n acrylamide nị ẩ ồng độ 20 ppm trong n c pha loãng ướ 6 nồng độ ằ b ng dung dịch chiết m u tr ng ẫ ắ là 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 1,6; 2,0 ppm
Tiế hành sắc ký với chương trình đã chọn thu được kến t qu ả như sau: B ng 9ả : Kết quả xây dựng đường chu n ẩ
Stt Nồng độ (ppb) Diện tích pic (mAU*s) 1 200 33,35 2 400 71,9070 3 800 146,658 4 1000 186,6740 5 1600 306,9540 6 2000 384,4750 Phương trình hồi quy Y=0,1956x-7,2852 Hệ số tương quan bình phương 0,9998
T kừ ết quả thu được chúng tôi biểu di n s ph ễ đồ thị ự ụ thuộc ồng độ vào ện di n tích peak như sau:
Hình 23: Đường chu n AA 0,2 - 2,0 ppm ẩ y = 0.1956x - 7.2852 R² = 0.9998 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 1000 2000 3000 D iệ n tí ch ( m A U *s ) Nồng độ (ng/g) Đường chuẩn
Nhận xét: đường hồi quy có dạng đường thẳng và hệ ố tương quan ồ s h i quy r = 0,99 ch ng t s ứ ỏ ự tương quan tuyến tính là chặt ch [2]. ẽ