Tác dụng của tinh dầu sả đối với việc ức chế Alte- 123docz.net

5 Ứng dụng chất mùi trong thực phẩm

5.8 Tác dụng của tinh dầu sả đối với việc ức chế Alternaria Alternata trong cà chua anh đào (Chen, Xu et al 2014)

anh đào (Chen, Xu et al. 2014)

5.8.1 Nguyên liệu

Tinh dầu sả (Cymbopogon nardus). Tinh dầu sả nguyên chất được chiết xuất từ C. nardus (L.) Rendle (từ tỉnh Jiang Xi, Trung Quốc) bằng cách chưng cất nước được mua từ Tập đoàn tinh dầu Yue Yu (tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc). Dầu được bảo quản ở 4°C trước khi sử dụng.

Chủng nấm: Alternaria Alternata được thu từ Viện Vi sinh, Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc đã được nuôi cấy trên môi trường thạch PDA (Potato dextrose agar) ở 25°C trong 10-12 ngày.

5.8.2 Phương pháp thực hiện

Hoạt tính kháng nấm của tinh dầu chống lại A.Alternata được xác định bằng phương pháp của Singh et al.20 với một số sửa đổi. Tinh dầu được hòa tan và pha loãng gấp 10 lần trong 5ml dung dịch Tween 20 và trộn vô trùng với môi trường PDA ở 40-45°C để thu được nồng độ dầu là 0 (đối chứng), 0.2, 0.4, 0.6, 1 và 1.2µl . Môi trường hỗn hợp được chuyển vào các đĩa Petri 90 mm (15 mL mỗi đĩa). Một đĩa sợi nấm được cắt từ nuôi cấy A.Alternata 10 ngày tuổi được trồng trên máy PDA được đặt ở trung tâm của mỗi đĩa Petri và sau đó được ủ ở 25°C. Đường kính trung bình của sự phát triển sợi nấm được xác định mỗi ngày trong 7 ngày. Tất cả các phương pháp điều trị bao gồm năm lần lặp lại và toàn bộ thí nghiệm được thực hiện ba lần. Giá trị tăng trưởng trung bình được chuyển đổi thành phần trăm ức chế sợi nấm. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được định nghĩa là nồng độ thấp nhất của dầu ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng sợi nấm.

• Xét nghiệm hoạt tính kháng nấm trên cơ thể sống của quả cà chua

Xét nghiệm kháng nấm của tinh dầu chống lại A. Alternata trong ống nghiệm trên cà chua anh đào được thực hiện bằng phương pháp sửa đổi của Feng và Zheng10 (thử nghiệm bệnh lý quả). Cà chua anh đào tươi trưởng thành và khỏe mạnh từ Học viện Khoa học Nông nghiệp Chiết Giang được nhúng vào 1ml sodium hypochlorite trong 1 phút, rửa sạch trong nước và sấy khô ở nhiệt độ phòng. Mỗi quả được cắt ở vùng xích đạo có đường kính 4 mm và lỗ sâu 2 mm bằng cách sử dụng dụng cụ bấm vô trùng để tạo vết thương. Các quả sau đó được chia ngẫu nhiên thành sáu nhóm và được đặt trong các thùng chứa (hộp nhựa trắng 21 cm × 15 cm). Một dịch huyền phù bào tử 10μL ( bào tử m) được tiêm vào mỗi vết thương. Sau 30 phút, 20µl dung dịch dầu có nồng độ 0 (đối chứng), 0.2, 0.5, 0.8, 1, 1.5 và 2 μL m được bơm vào từng vết thương. Các thùng chứa được niêm phong bằng bọc nhựa để duy trì độ ẩm tương đối cao (RH) 90-95% trong quá trình bảo quản. Tỷ lệ mắc bệnh của các quả được đo sau 5 ngày bảo quản ở 25°C. Hai mươi quả được xử lý và mỗi lần xử lý được lặp lại ba lần trong một thí nghiệm. Chất lượng của quả được xử lý dầu / không được xử lý được đánh giá về sự mất khối lượng, độ cứng của quả, tổng chất rắn hòa tan (TSS) và độ axit chuẩn độ (TA) sau khi nhiễm nấm. Tất cả các chỉ số chất lượng được đo trước và sau 15 ngày bảo quản (13°C, 85% RH).

• Tác dụng của tinh dầu đối với trọng lượng sợi nấm ướt và khô

Tác dụng của tinh dầu đối với trọng lượng sợi nấm ướt và khô của mầm bệnh được đo bằng phương pháp của Dikbas et al. Tinh dầu được hòa tan và pha loãng gấp 10 lần trong 5ml dung dịch Tween 20 và chuyển vào bình Erlen với 50ml môi trường PDB để thu được nồng độ dầu 0 (đối chứng), 0.1, 0.3, 0.5, 0.7 và 0.9μL m. Sau đó, 100μL huyền phù bào tử của mầm bệnh ( bào tử m) được cấy vào từng bình và các bình được ủ trên máy lắc quay ở 0,58 × g và 25°C. Sợi nấm được thu hoạch vào ngày 5 và 10 bằng cách ly tâm ở tốc độ 3260 × g trong 15 phút và kết tủa được rửa hai lần bằng cách nhúng chúng vào nước vô trùng chưng cất và lọc trong 30 phút. Các sợi nấm ướt được cân. Sợi nấm khô được cân sau khi sấy sợi nấm ướt ở 60°C trong 12 giờ. Mỗi lần xử lý bao gồm ba lần lặp lại và các thí nghiệm được thực hiện ba lần.

• Kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử (SEM) về tác dụng của tinh dầu đối với hình thái học

Phân tích SEM (S-3000N, Hitachi Limited, Tokyo, Nhật Bản) được thực hiện bằng phương pháp của Lu et al.23 với một số sửa đổi. Các nấm mười ngày tuổi của

A.Alternata nuôi cấy trong môi trường PDB (đối chứng) và môi trường PDB có nồng độ dầu hiệu quả nhất được SEM quan sát. Glutaraldehyd (250 mL ., Ted Pella, Inc., Redding, CA, USA) ở nồng độ 25ml . trong 0.1 mol dung dịch muối phosphat (PBS) (pH 7.2) đã được thêm vào mẫu nấm và cố định qua đêm ở 4°C. Các mẫu cố định sau đó được xử lý theo các bước sau. Mỗi mẫu được rửa với 0,1 mol PBS (pH 7.2) ba lần trong 15 phút, cố định lại bằng 5 ml dung dịch tetroxide osmium (40 ml dung dịch nước, Ted Pella, Inc.) trong 1-2 giờ và rửa lại bằng PBS (pH 7.2). Các mẫu cố định được trải qua một loạt các quá trình khử nước acetone được phân loại (500, 700, 800, 900 và 950 mL , 15 phút cho mỗi nồng độ) và sau đó khử nước hai lần bằng ethanol tinh khiết trong 20 phút. Sau khi xử lý bằng hỗn hợp ethanol và isoamyl acetate trong 30 phút, các mẫu được xử lý bằng isoamyl acetate tinh khiết trong 1-2 giờ. Sau khi khử nước, các mẫu được sấy khô trong máy sấy điểm tới hạn (HCP-2, Hitachi Limited) tại điểm quan trọng theo hướng dẫn của nhà sản xuất và gắn trên cuống bằng keo dính carbon. Cuối cùng, các mẫu được phủ một

lớp vàng / palladium bằng phương pháp phun lớp phủ ion (E-1010, Hitachi Limited) và được quét và chụp ảnh bởi SEM ở 15 kV.

• Xác định các thành phần dầu bằng sắc ký khí / khối phổ (GC / MS)

Thành phần hóa học của tinh dầu được phân tích bởi GC / MS (5975I, Agilent Co., Santa Clara, CA, USA). Các thành phần được phân tách trên cột mao quản 30m × 250µm × 0,25µm (HP-5MS, Công ty Agilent). Helium có độ tinh khiết cao được sử dụng làm khí mang ở tốc độ dòng không đổi 1mL . Áp suất ở đầu vào cột là 9.37psi. Nhiệt độ cột GC ban đầu được giữ 40°C trong 1 phút và sau đó tăng lên với tốc độ 10°C đến 280°C và được giữ trong 6 phút. Nhiệt độ của lò sưởi phụ được duy trì ở 280°C. Các thành phần rửa giải được phát hiện bằng máy quang phổ khối ion hóa (EI) (chế độ EI, 70 eV). Thu thập dữ liệu ở chế độ quét toàn bộ trong phạm vi m/z 45-500. Nhiệt độ của nguồn ion và tứ cực được đặt tương ứng là 230 và 150°C. Hàm lượng tương đối của dầu được tính bằng tỷ lệ phần trăm theo phương pháp bình thường hóa diện tích cực đại. Các hợp chất dầu được xác định bằng cách so sánh các chỉ số lưu giữ thu được theo dung dịch chuẩn n- ankan (C7, C26) với các hợp chất đã biết trong tài liệu tham khảo các tiêu chuẩn xác thực và bằng cách so sánh phổ khối của chúng với cơ sở dữ liệu phổ NIST/NIH/EPA và cả bằng cách giải thích thủ công.

• Phân tích thống kê

Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình độ lệch chuẩn (n=3). Tất cả dữ liệu được phân tích phương sai đơn nhân (ANOVA) bằng SPSS Statistics 17.0 (SPPS Inc., Chicago, IL, USA). Sự khác biệt đáng kể về giá trị trung bình được đánh giá bằng thử nghiệm đa phạm vi của Duncan ở mức P <0.05.

5.8.3 Kết quả

• Xét nghiệm hoạt tính kháng nấm trong ống nghiệm

Kết quả chỉ ra rằng đường kính của sợi nấm tăng lên khi tăng thời gian ủ bệnh. Ngoài ra, sự tăng trưởng sợi nấm của tất cả các phương pháp điều trị bị ức chế đáng kể so với sự

kiểm soát theo cách phụ thuộc vào liều. Sự bắt đầu tăng trưởng sợi nấm có thể nhìn thấy đã bị trì hoãn 2 ngày ở mức 0.6μL m và 3 ngày ở mức 0.8μL m, trong khi sự tăng trưởng của sợi nấm bị ức chế hoàn toàn ở mức 1μL m trong toàn bộ thời gian ủ bệnh. Tỷ lệ ức chế xử lý tinh dầu tính sau 7 ngày ủ là 26-100% với nồng độ dầu là 0.2-1μL m.

• Hoạt tính kháng nấm trên cơ thể sống của quả cà chua

Tỷ lệ mắc bệnh của tất cả các phương pháp điều trị ngoại trừ 0.2μL m đã giảm đáng kể (P <0.05) so với đối chứng. Nồng độ dầu 1.5μL m thể hiện hoạt tính kháng nấm lớn nhất, giảm tỷ lệ mắc bệnh xuống 48% so với đối chứng. Tỷ lệ mắc bệnh ở nồng độ dầu là 0.2- 1.5μL m là 88-48%. Tỷ lệ mắc bệnh khi điều trị ở mức 2µL m cao hơn đáng kể so với 1.5μL m. Sau 15 ngày bảo quản, tăng tổn thất khối lượng và giảm độ cứng của quả, TSS và TA đã được quan sát, trong khi dầu không có tác dụng đáng kể đối với bốn chỉ số này sau thời gian bảo quản.

• Tác dụng của tinh dầu đối với sự nảy mầm của bào tử A.alternata

Kết quả chỉ ra rằng xử lý dầu đáng kể (P <0.05) ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm so với đối chứng theo cách phụ thuộc vào liều sau 12 giờ ủ ở 25°C. Sự nảy mầm của bào tử bị ức chế không hoàn toàn ở nồng độ dầu 0.1-1.5μL m trong môi trường PDB, với tỷ lệ nảy mầm của bào tử giảm từ 54 đến 13%.

• Tác dụng của tinh dầu đối với A.alternata trọng lượng sợi nấm ướt và khô Vào ngày thứ 5, sinh khối của sợi nấm cho tất cả các phương pháp điều trị ngoại trừ 0.2μL m đã giảm đáng kể (P <0.05) so với đối chứng và không có sợi nấm nào được tạo ra ở nồng độ dầu 0.6 và 0.8µL m. Vào ngày thứ 10, sinh khối sợi nấm cho các phương pháp điều trị ở mức 0.4 và 0.6μL m tăng đáng kể so với ngày thứ 5. Không thấy sự tăng trưởng của sợi nấm vào ngày thứ 5 hoặc ngày 10 đối với việc điều trị ở mức 0,8μL m, tức là sản xuất sợi nấm đã bị ức chế hoàn toàn. Do đó, nồng độ 0.8μL m của dầu sả là hiệu quả nhất và được coi là MIC cho A.Alternata trong môi trường PDB.

Các sợi nấm A.alternata phát triển trong môi trường PDB khi sự kiểm soát cho thấy hình thái thường xuyên và bình thường với bào tử phong phú. Hơn nữa, sự kiểm soát rõ ràng cho thấy sự phát triển lành mạnh của bào tử và sợi nấm đầy đặn, nguyên vẹn với bề mặt bên ngoài mịn màng. Ngược lại, hình thái sợi nấm thay đổi nghiêm trọng sau khi điều trị với nồng độ tinh dầu hiệu quả nhất được xác định trong môi trường PDB. Các sợi nấm gấp lại và làm phẳng với một bề mặt gồ ghề và biến dạng mà không có bào tử, và sợi nấm được điều trị cũng cho thấy hình thái sợi nấm bất thường với sợi nấm rỗng và nhăn nheo.

5.8.4 Kết luận

Kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng tinh dầu sả có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với

A.Alternata trong ống nghiệm và trên cơ thể sống. MIC trong môi trường PDA và PDB lần lượt là 1 và 0.8µL m. Trên cơ thể sống liều lượng hiệu quả nhất của dầu là 1.5μL m, với mức giảm 52% và dầu không có tác động tiêu cực đến chất lượng trái cây. Quan sát SEM cho thấy hình thái sợi nấm bất thường đáng kể. TInh dầu sả có thể là một sản phẩm tự nhiên đầy hứa hẹn để sử dụng như một chất chống A.Alternata để kiểm soát thối đen trong cà chua anh đào. Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm để điều tra phương thức hoạt động của tinh dầu.