Củ của cây sâm Ngọc Linh 2 năm tuổi được thu nhận, rửa sạch, phơi khô và nghiền thành bột. Bột (0,5 g) được chiết hoàn toàn trong metanol bằng máy sonicator (10 mL metanol x 6 lần). Sau đó, dung dịch này được làm bay hơi bằng thiết bị bay hơi để làm khô cặn. Các chất cô đặc được hòa tan trong 20 mL nước và được phân đoạn bằng ethylic và n-butanol. N-butanol được cô trong áp suất chân không để thu được dịch chiết khô. Dịch chiết đã làm khô được hòa tan bằng hỗn hợp dung môi nước axetonitril (2:1) và được lọc qua màng 0,45 mm. Dịch lọc cuối cùng được đưa vào hệ thống HPLC để xác định định lượng saponin bằng cách sử dụng phương pháp đường chuẩn. Hệ thống HPLC: Cột Supelco RP C18 (250 mm x 4,6 mm; I.D. 5 mm) và máy dò SPD-M20A-PDA (Shimadzu) đã được sử dụng. Thông số HPLC: thể tích tiêm 20 mL; tốc độ dòng 0,5 mL/phút. Nhiệt độ cột được giữ ở 25°C [171].
ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
Điều kiện nuôi cấy in vitro: Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ phòng 25 ± 2oC, chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ 40 – 45 µmol.m-
2.s-1 dưới ánh sáng đèn huỳnh quang, độ ẩm trung bình 55 – 60%.
Điều kiện nuôi cấy ex vitro: Các thí nghiệm được tiến hành trong nhiệt độ ban ngày 27 ± 2oC, nhiệt độ ban đêm 14 ± 2oC, độ ẩm 65 – 70%, ánh sáng được che phủ 50 – 90% tuỳ thuộc vào từng thí nghiệm, giá thể được sử dụng là Klasmann TS1 với pH khoảng 5,5 – 6,5.
ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
Thí nghiệm nuôi cấy in vitro được thực hiện tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên), số 116, đường Xô Viết Nghệ Tĩnh, phường 7, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
Thí nghiệm nuôi cấy ex vitro được thực hiện tại công ty cổ phần Công nghệ Sinh học Thái Dương, lô C18, khu quy hoạch viện Nghiên cứu hạt nhân, đường Hùng Vương, phường 11, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
Thí nghiệm đo ethylene được thực hiện tại Viện Cây ăn quả miền Nam, QL1A, xã Long Định, huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang.
Thí nghiệm xác định hàm lượng Ag được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân, số 1, đường Nguyên Tử Lực, phường 8, thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
Thí nghiệm xác định mật độ tế bào được thực hiện tại Viện Sinh học Nhiệt đới, số 9/621, Xa lộ Hà Nội, khu phố Linh Trung, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Thí nghiệm quan sát bề mặt mô sẹo được thực hiện tại phòng hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, số 1, đường Yersin, thành phố Hà Nội.
Thí nghiệm xác định hàm lượng saponin được thực hiện tại Trung tâm Sâm và Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh, số 41, đường Đinh Tiên Hoàng, phường Đa Kao, quận 1, thành phố Hồ Chí Minh.
Thời gian thực hiện thí nghiệm từ 11/2016 – 2/2021.
PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ THỐNG KÊ
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi được xử lý bằng phần mềm MicroSoft Excel® 2017 và phần mềm phân tích thống kê SPSS 16.0 theo phương pháp Duncan’s test với a = 0,05 [52].
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA AgNPs LÊN KHỬ TRÙNG BỀ MẶT VÀ CẢM ỨNG MẪU CẤY
3.1.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem
Phương pháp khử trùng bề mặt mẫu cấy phổ biến là sử dụng các chất hoá học thông dụng [Ca(ClO)2, HgCl2, …] có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn, nhưng những chất này lại gây hại đối với mẫu cấy và con người. Vì vậy, thí nghiệm này nhằm tìm ra loại chất khử trùng ở nồng độ và thời gian phù hợp có hiệu quả cao trong khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy nhưng phải ít độc nhằm thay thế các chất khử trùng thông dụng.
Mẫu lá được khử trùng bằng HgCl2 đã xuất hiện nấm sau 1 tuần nuôi cấy; trong khi đó, mẫu lá khử trùng bằng AgNPs chưa ghi nhận được tỷ lệ nhiễm. Do đó, bước đầu có thể thấy AgNPs có hiệu quả khử trùng vượt trội hơn so với HgCl2. Sau 2 tuần nuôi cấy, tỷ lệ nhiễm nấm và khuẩn bắt đầu được ghi nhận ở các nghiệm thức khử trùng bằng AgNPs. Kết quả cho thấy, các mẫu lá khử trùng với 0,05 g/L AgNPs trong 5 – 10 phút và 0,1 g/L AgNPs trong 5 phút bị nhiễm nấm hoàn toàn (Bảng 3.1). Sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ nhiễm của mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút và 0,5 g/L AgNPs trong 15 phút là thấp nhất (26,66%) trong thí nghiệm (Bảng 3.1). Bên cạnh đó, tỷ lệ nhiễm của các mẫu cấy được xử lý bằng AgNPs tăng khi thay đổi nồng độ hay thời gian khử trùng so với nồng độ tối ưu của AgNPs (0,2 g/L AgNPs trong 20 phút và 0,5 g/L AgNPs trong 15 phút) (Bảng 3.1). Vì vậy, ở các nghiệm thức khử trùng bằng AgNPs sự thay đổi cả về nồng độ và thời gian đều có ảnh hưởng tích cực đến hiệu quả của quá trình khử trùng.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem sau 4 tuần nuôi cấy
Chất Nồng khử độ trùng (g/L) 0,05 0,1 AgNPs 0,2 0,5 HgCl2 1
Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức a = 0,05 trong phép thử Duncan, ký hiệu (-) thể hiện những nghiệm thức không có mẫu thành công.
Hình 3.1. Sự cảm ứng khác nhau của các mẫu lá salem được khử trùng bằng AgNPs so với HgCl2 sau 4 tuần nuôi cấy
a: mẫu lá được khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút; b: mẫu lá được khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 30 phút c: mẫu lá được khử trùng bằng 1 g/L HgCl2 trong 5 phút; sau 4 tuần nuôi cấy.
Sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh mô sẹo của mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút và 0,5 g/L AgNPs trong 15 phút (73,33%) cao hơn so với các nghiệm còn lại (Bảng 3.1). Trong đó, tất cả các mẫu lá khử trùng bằng AgNPs có dấu hiệu cảm ứng mô sẹo sớm nhất trong tuần đầu tiên. Sau đó, các mẫu lá khử trùng bằng 1 g/L HgCl2 trong 5 phút cảm ứng mô sẹo sau tuần thứ ba trên cùng một môi trường thí nghiệm. Mặt khác, khối lượng tươi (0,73 – 0,74 g) của mô sẹo từ mẫu lá khử trùng với 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong thời gian 15 – 20 phút cao hơn so với với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút (0,64 g). Đặc biệt, mẫu lá khử trùng với 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút cho thấy sự phát triển của mô sẹo xốp có cấu trúc giống phôi, nhiều sơ khởi phôi có màu trắng sữa và xuất hiện rễ bất định là nguồn vật liệu tiềm năng cho quá trình phát sinh phôi hay huyền phù tế bào (Hình 3.1a); 0,5 g/L AgNPs trong 15 phút cho thấy sự phát triển của mô sẹo xốp có cấu trúc giống phôi, nhiều sơ khởi phôi có màu xanh. Các mẫu lá ở các nồng độ AgNPs còn lại cho thấy có sự xuất hiện các mô sẹo xốp với các mức độ khác nhau phụ thuộc vào nồng độ AgNPs và thời gian xử lý mẫu cấy. Bên cạnh đó, ở nồng độ 1 g/L HgCl2 trong 5 phút là các mô sẹo cứng có màu ngả vàng (Hình 3.1c). Ngoài ra, mẫu lá ở tất cả các nồng độ AgNPs trong thời gian 30 phút có sự ức chế sau 4 tuần nuôi cấy; mẫu bị hoá nâu và hoại tử (Hình 3.1b). Vậy, có thể thấy ở các mẫu lá được khử trùng bằng AgNPs trong thời gian dài sẽ gây hiện tượng ức chế mẫu cấy.
Như vậy, khi xử lý mẫu cấy bằng AgNPs ở nồng độ từ 0,2 g/L trong 20 phút và 0,5 g/L trong 15 phút không chỉ có hiệu quả cao trong khử trùng mẫu cấy mà còn có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh mô sẹo của mẫu lá cây salem.
3.1.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây
Sau 6 tuần nuôi cấy, kết quả ghi nhận cho thấy khả năng khử trùng mẫu lá của AgNPs ở các nồng độ và thời gian xử lý khác nhau có sự khác biệt so với HgCl2 (Bảng 3.2). Quá trình tái sinh chồi từ lá cây dâu tây là một quá trình chuyển tiếp gồm 3 giai đoạn bao gồm cảm ứng mô sẹo, tái sinh chồi và sự tăng trưởng của chồi (Hình 3.2).
Mẫu lá được khử trùng bằng 0,05 – 0,5 g/L AgNPs trong 5 phút nhiễm nấm 100% trong tuần đầu tiên; 0,05 g/L AgNPs trong 10 – 30 phút đều bị nhiễm nấm và khuẩn sau 6 tuần nuôi cấy; 0,1 – 0,5 g/L AgNPs trong thời gian 30 phút cho thấy các mẫu lá bị hoại tử và hoá nâu, sau đó nấm và khuẩn phát triển sau 6 tuần nuôi cấy (Bảng 3.2). Điều này cho thấy, AgNPs ở nồng độ thấp (0,05 g/L) hoặc thời gian ngắn (5 phút), dài (30 phút) đều không có hiệu quả trong quá trình khử trùng. Mặt khác, mẫu lá được khử trùng 0,1 g/L – 0,5 g/L AgNPs trong thời gian 10 – 20 phút cho tỷ lệ nhiễm thấp (Bảng 3.2). Đặc biệt, ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong thời gian 20 phút (22,22% – 28,89%) cho tỷ lệ nhiễm thấp so với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút (49,99%) (Bảng 3.2).
Bên cạnh đó, sự sinh trưởng của mẫu cấy cho thấy các mẫu lá ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút cảm ứng mô sẹo sớm nhất trong tuần đầu tiên và phát sinh chồi ở tuần thứ 2; sớm hơn so với các nghiệm thức bổ sung AgNPs khác (các mô sẹo xuất hiện rải rác ở tuần thứ 2, phát sinh chồi ở tuần thứ 3) và HgCl2 các mô sẹo xuất hiện ở tuần thứ 3, phát sinh chồi ở tuần thứ 4. Sau 3 tuần nuôi cấy, các mẫu lá được khử trùng bằng AgNPs đã trải qua giai đoạn hình thành mô sẹo và đang trong quá trình hình thành chồi (Hình 3.2a); so với chỉ hình thành mô sẹo ở 5 g/L HgCl2 trong 5 phút (Hình 3.2c).
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây sau 6 tuần nuôi cấy
Chất Nồng khử độ trùng (g/L) 0,05 0,1 AgNPs 0,2 0,5 HgCl2 1
Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức a = 0,05 trong phép thử Duncan, ký hiệu (-) thể hiện những nghiệm thức không có mẫu thành công.
Tỷ lệ tái sinh chồi ở mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút và 0,5 g/L AgNPs trong 10 – 20 phút (45,55 – 64,44%) tương tự với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút (46,66%) sau 6 tuần nuôi cấy. Số chồi ở mẫu lá khử trùng bằng 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút (15,66 – 21,00) tương tự với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút (13,66). Tuy nhiên, ở 1 g/L HgCl2 trong 5 phút không ghi nhận được số lượng chồi cao hơn 1,5 cm. Số lượng chồi cao hơn 1,5 cm ghi nhận cao nhất (6,66) các ở mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút. Các chồi hình thành ở 1 g/L HgCl2 trong 5 phút có sự phân nhánh khá cao, từ một chồi hình thành thêm 2 – 3 chồi mới có kích thước nhỏ hơn 1,5 cm và có hình thái bất thường (Hình 3.2d) và bị hiện tượng thuỷ tinh thể. Những chồi ở mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút có sự hình thành chồi đơn rõ ràng, các chồi to, khoẻ, tách nhau ra riêng biệt (Hình 3.2b). Đây là nguồn vật liệu tốt cho quá trình vi nhân giống.
Hình 3.2. Sự cảm ứng khác nhau của các mẫu lá cây dâu tây được khử trùng bằng
AgNPs so với HgCl2 sau 3 và 6 tuần nuôi cấy
a, b: mô sẹo và chồi ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút sau 3 và 6 tuần nuôi cấy; c, d: mô sẹo và chồi ở nghiệm thức khử trùng bằng HgCl2 sau 3 và 6 tuần nuôi cấy.
Như vậy, các mẫu lá cây dâu tây được xử lý bằng 0,2 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút cho tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ tái sinh chồi cũng như số chồi cao hơn so với 5 g/L HgCl2 trong 5 phút. Đặc biệt ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút cho chất lượng chồi tốt nhất so với các nghiệm thức còn lại.
3.1.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây sâm Ngọc Linh
Tất cả các mẫu lá được khử trùng bằng 0,05 g/L trong 5 – 20 phút, 0,1 g/L AgNPs trong 5 – 10 phút và 0,2 g/L AgNPs trong 5 phút đều ghi nhận nhiễm nấm 100%; 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong 30 phút cho thấy các mẫu hoá nâu, hoại tử và sinh khuẩn sau 6 tuần nuôi cấy (Bảng 3.3). Ở các nồng độ AgNPs còn lại và 1 g/L HgCl2 trong 5 phút có số lượng nhiễm dao động từ 20 – 70% phụ thuộc vào nồng độ và thời gian khử trùng. Trong đó, tỷ lệ nhiễm của mẫu lá được khử trùng bằng 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút (20,00 – 36,67%) thấp hơn đáng kể so với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút (48,88%). Tỷ lệ hình thành mô sẹo của mẫu lá được khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút và 0,5 g/L AgNPs trong 10 – 20 phút (45,55 – 72,22%) tương đồng với 1 g/L HgCl2 trong 5 phút) (46,66 – 56,66%) (Bảng 3.3).
Ngoài ra, các mẫu lá được khử trùng bằng AgNPs cho thấy các mô sẹo cảm ứng xung quanh mép cắt của lá sau 1 tuần nuôi cấy (Hình 3.3a); sau đó cảm ứng trên toàn bộ bề mặt lá (Hình 3.3b); 1 g/L HgCl2 trong 5 phút cho sự cảm ứng mô sẹo muộn hơn (tuần thứ 3). Các mẫu lá được khử trùng AgNPs cho các mô sẹo xốp dần, sinh phôi và đôi khi có hình thành cụm mô với kết cấu tơi xốp trắng sau 4 tuần nuôi cấy (Hình 3.3c). Các mẫu lá khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút cho khối lượng tươi mô sẹo đạt cao nhất là 0,77 g; và các mô sẹo ở nghiệm thức này màu trắng ngà và có khả năng phát sinh phôi sau 6 tuần nuôi cấy (Hình 3.3d,e). Các mẫu lá khử trùng 1 g/L HgCl2 trong 5 phút cho các mô sẹo hoá nâu và hoại tử (Hình 3.3f). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy hiệu quả của AgNPs là khá rõ ràng trong thí nghiệm này; các chất khử trùng thông dụng như HgCl2 có sự cảm ứng mô sẹo chậm hơn so với AgNPs cũng như khả năng biệt hoá tạo mô sẹo không cao và không rõ ràng như AgNPs mặc dù tất cả các nghiệm thức trong thí nghiệm đều hình thành mô sẹo và có cấu trúc cơ bản giống nhau.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây sâm Ngọc Linh sau 6 tuần nuôi cấy
Chất Nồng khử độ trùng (g/L) 0,05 0,1 AgNPs 0,2 0,5 HgCl2 1
Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức a = 0,05 trong phép thử Duncan, ký hiệu (-) thể hiện những nghiệm thức không có mẫu thành công.
Hình 3.3. Sự cảm ứng khác nhau của các mẫu lá sâm Ngọc Linh được khử trùng bằng AgNPs so HgCl2 sau 1, 2, 4 và 6 tuần nuôi cấy
a, b, c, d: mô sẹo ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút sau 1, 2, 4 và 6 tuần nuôi cấy; e: Các mô phôi hình cầu (quan sát dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại: 1.000.000) ở nghiệm thức khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút sau 6 tuần nuôi cấy; f: mô sẹo ở nghiệm thức khử trùng bằng HgCl2 sau 6 tuần nuôi cấy.
Như vậy, có thể thấy mẫu được xử lý 0,2 – 0,5 g/L AgNPs trong 15 – 20 phút cho hiệu quả khử trùng cũng như tỷ lệ tái sinh cao. Tuy nhiên, chỉ có các mẫu lá được khử trùng bằng 0,2 g/L AgNPs trong 20 phút cho hiệu quả khử trùng cũng như khối lượng mô sẹo và hình thái mô sẹo tốt nhất.
Khử trùng là một trong những giai đoạn quan trọng quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy in vitro. Công dụng của AgNPs trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để