mẫu cấy
Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem.
Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây.
Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây sâm Ngọc Linh.
2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại
mẫu trong nuôi cấy in vitro
Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem nuôi cấy in vitro.
Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự tái sinh chồi từ huyền phù tế bào cây salem nuôi cấy in vitro.
Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng phát sinh và tăng sinh phôi vô tính từ mô sẹo cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro.
2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con
hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro
Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem nuôi cấy in vitro.
Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây dâu tây nuôi cấy in vitro.
Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro.
2.2.4. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu
ở giai đoạn ex vitro
Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây salem in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro.
Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây dâu tây in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro.
Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây sâm Ngọc Linh in vitro
nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.3.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy
Lá non của cây salem (3 tháng tuổi), dâu tây (3 tháng tuổi) và sâm Ngọc Linh (3 năm tuổi) được xử lý sơ bộ bằng cách rửa sạch dưới vòi nước máy. Sau đó các lá được đưa vào tủ cấy vô trùng và ngâm với cồn 70% trong 30 giây, rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần. Các lá này tiếp tục được khử trùng bằng dung dịch AgNPs với các nồng độ khác nhau (0,05; 0,1; 0,2; 0,5 g/L) trong các khoảng thời gian thay đổi (5; 10; 15; 20; 30 phút) và so sánh với nghiệm thức đối chứng là 1 g/L HgCl2 trong 5 phút trên đối tượng cây salem [83], dâu tây [122], sâm Ngọc Linh [53]. Những mẫu lá này sau khi khử trùng được rửa lại với nước cất khử trùng 3 lần và cắt thành hình tròn có đường kính 1 cm bằng dụng cụ cắt [11] dọc theo 2 bên gân chính của lá (không bao gồm gân chính). Các mẫu lá này được cấy trên các môi trường khác nhau với 30 bình thuỷ tinh (100 mL chứa 15 mL môi trường) trên 1 nghiệm thức, mỗi bình cấy 1 mẫu.
Thí nghiệm 1.1: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem
Mẫu lá cây salem (đường kính 1 cm) sau khi khử trùng được cấy trên môi trường ½MS có bổ sung 20 g/L sucrose; 1 mg/L picloram và 2,5 g/L gelrite [78]. Tỷ lệ nhiễm (%), khối lượng tươi (g), khối lượng khô (g) và hình thái mẫu được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 1.2: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây
Mẫu lá dâu tây (đường kính 1 cm) sau khi khử trùng được cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/L TDZ, 0,1 mg/L IBA, 30 g/L sucrose và 8,5 g/L agar [151]. Tỷ lệ nhiễm (%), tỷ lệ tái sinh chồi (%), số chồi/mẫu, chồi cao > 1,5 cm và hình thái mẫu được ghi nhận sau 6 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 1.3: Khảo sát ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá sâm Ngọc Linh
Mẫu lá sâm Ngọc Linh (đường kính 1 cm) sau khi khử trùng được cấy trên môi trường SH có bổ sung 1 mg/L 2,4-D, 0,2 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose và 8,5 g/L agar
[15]. Tỷ lệ nhiễm (%), tỷ lệ cảm ứng mô sẹo (%), khối lượng tươi (g) và hình thái mẫu được ghi nhận sau 6 tuần nuôi cấy.
2.3.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghiệm 2.1: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem nuôi cấy in vitro
Mô sẹo xốp thu nhận từ thí nghiệm 1.1 được cấy chuyền để đảm bảo số lượng và tính đồng nhất; sau đó cấy vào môi trường lỏng ½MS có bổ sung 1 mg/L picloram và 20 g/L sucrose [78] và AgNPs được bổ sung với các tỷ lệ khác nhau (0,0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L). Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 5 bình tam giác (250 mL chứa 100 mL môi trường), mỗi bình cấy 0,1 g mô sẹo xốp. Tất cả nghiệm thức được đặt trên máy lắc (Hermle, Ðức) với tốc độ 100 vòng/phút. Số lượng tế bào đơn được ghi nhận sau 4; 8; 12; 16; 20; 24; 28 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs lên sự tái sinh chồi từ huyền phù tế bào cây salem nuôi cấy in vitro
Huyền phù tế bào (0,5 mL) thu nhận từ nghiệm thức tốt nhất ở thí nghiệm 2.1 được cấy vào môi trường ½MS có bổ sung 1 mg/L zeatin, 2,5 g/L gelrite, 20 g/L sucrose [78] và AgNPs được bổ sung với các tỷ lệ khác nhau (0,0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L). Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (100 mL chứa 15 mL môi trường), mỗi bình cấy 0,5 mL thể tích huyền phù tế bào. Tỷ lệ tái sinh chồi (%), số chồi/bình, chiều cao chồi (cm), số chồi > 1,5 cm/bình và khối lượng tươi (g) được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình phát sinh và tăng sinh phôi vô tính từ mô sẹo cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
Mô sẹo thu nhận từ thí nghiệm 1.3 được cắt nhỏ (1,5 × 1,5 cm) với khối lượng khoảng 0,5 g và cấy chuyền để đảm bảo số lượng và tính đồng nhất; sau đó cấy vào môi trường MS có chứa 1 mg/L 2,4-D, 0,5 mg/L NAA, 0,2 mg/L Kin, 30 g/L sucrose, 8,5 g/L agar [119] và AgNPs được bổ sung với các tỷ lệ khác nhau (0,0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L). Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (100 mL chứa 15 mL môi trường), mỗi bình cấy 1mẫu. Số phôi/bình, số chồi, số chồi > 3 cm, khối lượng tươi (g), khối lượng khô (mg) được ghi nhận sau 14 tuần nuôi cấy.
2.3.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro
Thí nghiệm 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem nuôi cấy in vitro
Chồi đơn cây salem (1,5 cm) thu nhận từ thí nghiệm 2.2 được cấy chuyền để đảm bảo số lượng và tính đồng nhất; sau đó cấy vào môi trường MS chứa 0,4 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, 8,5 g/L agar [59] và bổ sung AgNPs (0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L), hoặc thay thế Fe-EDTA bởi FeNPs (0,7; 1,4; 2,8; 5,6; 8,4; 11,2 mg/L). Đối chứng là môi trường không bổ sung hoặc thay thế các nano kim loại. Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (250 mL chứa 30 mL môi trường), mỗi bình cấy 5 mẫu. Tỷ lệ ra rễ (%), chiều cao cây (cm), chiều rộng lá (cm), chiều dài rễ (cm), khối
lượng tươi (g), khối lượng khô (mg), chlorophyll (nmol/cm2), hàm lượng AgNPs hấp thu (µg/kg), khí ethylene tích luỹ được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây dâu tây nuôi cấy in vitro
Chồi đơn cây dâu tây (1,5 cm) thu nhận từ thí nghiệm 1.2 được cấy chuyền để đảm bảo số lượng và tính đồng nhất; sau đó cấy vào môi trường MS chứa 0,02 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, 1 g/L than hoạt tính, 8,5 g/L agar [69] và bổ sung AgNPs (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/L) hoặc thay thế Fe-EDTA bởi FeNPs (0,7; 1,4; 2,8; 5,6; 11,2 mg/L). Đối chứng là môi trường không bổ sung hoặc thay thế các nano kim loại. Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (250 mL chứa 30 mL môi trường), mỗi bình cấy 5 mẫu. Tỷ lệ ra rễ (%), chiều cao cây (cm), số rễ/cây, chiều dài rễ (cm), khối lượng tươi (g), khối lượng khô (mg), chlorophyll (nmol/cm2), hàm lượng AgNPs hấp thu (µg/kg), khí ethylene tích luỹ được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm 3.3: Khảo sát ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro
Chồi đơn cây sâm Ngọc Linh (có kích thước trung bình là 1,5 cm) thu nhận từ thí nghiệm 2.3 được cấy chuyền để đảm bảo số lượng và chất lượng đồng nhất; sau đó được cấy vào môi trường SH chứa 1 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, 8,5 g/L agar
[117] và bổ sung AgNPs (0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 mg/L), hoặc thay thế Fe-EDTA bởi FeNPs (0,7; 1,4; 2,8; 5,6; 11,2 mg/L). Đối chứng là môi trường không bổ sung hoặc thay thế các nano kim loại. Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 30 bình (250 mL chứa 30 mL môi trường), mỗi bình cấy 3 mẫu. Tỷ lệ ra rễ (%), chiều cao cây (cm), số rễ/cây, đường kính củ (cm), chiều dài củ (cm), khối lượng tươi (g), khối lượng khô
(g), cholorophyll (nmol/cm2), hàm lượng AgNPs hấp thu (µg/kg), khí ethylene tích luỹ được thu nhận sau 12 tuần nuôi cấy.
2.3.1.4. Thí nghiệm 4: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng, phát triển và tích luỹ hoạt chất của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
Cây con salem (4 tuần), dâu tây (4 tuần), sâm Ngọc Linh (12 tuần) được thu nhận từ nghiệm thức tốt nhất của AgNPs, FeNPs và đối chứng lần lượt ở thí nghiệm 3.1, 3.2, 3.3, rửa sạch agar bám ở rễ, trồng trong vỉ xốp với giá thể là Klasmann TS1 để đánh giá khả năng thích nghi, sinh trưởng và phát triển của cây con nuôi cấy in vitro ở giai đoạn ex vitro. Mỗi nghiệm thức được tiến hành trên 100 cây ở đối tượng cây salem và dâu tây, 21 cây đối với sâm Ngọc Linh.
Thí nghiệm 4.1: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng và phát triển cây salem in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
Tỷ lệ sống (%), số lá, chiều cao cây (cm), diện tích lá (cm2), khối lượng tươi (g) và chlorophyll (nmol/cm2) được ghi nhận sau 6 tuần trồng trong điều kiện vườn ươm. Cây con ở điều kiện vườn ươm (6 tuần) được chuyển qua chậu nhựa (20 x 20 cm, giá thể Klasmann TS1) để tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát triển tiếp theo. Số lượng cành, chiều cao hoa (cm), số lượng dé/cành và khối lượng tươi (g) sau 12 tuần trồng trong điều kiện vườn ươm.
Thí nghiệm 4.2: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng và phát triển cây dâu tây in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
Tỷ lệ sống (%), số lá, chiều cao cây (cm), diện tích lá (cm2), khối lượng tươi (g) và cholorophyll (nmol/cm2) được ghi nhận sau 4 tuần trồng trong điều kiện vườn ươm. Cây con ở điều kiện vườn ươm (4 tuần) được chuyển qua bịch ni lon (20 x 15 cm, giá thể Klasmann TS1) để tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát triển tiếp theo. Chiều cao cây (cm), tỷ lệ đậu trái (%), số lượng ngó F1, F2, diện tích lá (cm2) và khối lượng tươi (g) được ghi nhận sau 12 tuần trồng trong điều kiện vườn ươm.
Thí nghiệm 4.3: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng, phát triển và tích luỹ hoạt chất của cây sâm Ngọc Linh in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro
Tỷ lệ sống (%), số lá, chiều cao cây (cm), diện tích lá (cm2), khối lượng tươi (g) và chlorophyll (nmol/cm2) được ghi nhận sau 6 tháng trồng trong điều kiện vườn ươm. Cây con ở điều kiện vườn ươm (6 tuần) được chuyển qua rổ nhựa (45 x 65 cm, giá thể Klasmann TS1) để tiếp thụ theo dõi sự sinh trưởng và phát triển tiếp theo. Số lá, chiều cao cây (cm), diện tích lá (cm2) và khối lượng tươi (g) được ghi nhận sau 18 tháng trồng trong điều kiện vườn ươm. Cây con 18 tháng tuổi được chuyển qua chậu nhựa (30 x 40 cm) và đặt trong nhà kính với độ ẩm phải dao động từ 85 – 90%, nhiệt độ dao động từ 15 – 200C trong ngày, cường độ ánh sáng dao động từ 6 – 15 µmol.m-2.giây-1 trong ngày. Khối lượng tươi (g), hàm lượng saponin (G-Rg1 (%), M-R2 (%), G-Rb1 (%) và G-Rg1 + M-R2 + G-Rb1 (%)) được ghi nhận sau 2 năm trồng trong điều kiện nhà kính.
2.3.2. Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu
Chiều cao cây (cm): được đo từ phần gốc đến đầu mép của lá dài nhất đối với cây salem và đến cuốn lá đối với cây dâu tây và sâm Ngọc Linh
Đường kính củ (cm): được đo từ bề mặt cắt ngan của củ Chiều dài củ (cm): được do từ phần gốc đến hết củ
Khối lượng tươi (g/mẫu): được xác định bằng cách cân khối lượng tươi.
Khối lượng khô (mg/mẫu hoặc g/mẫu): được xác định bằng cách cân khối lượng sau khi mẫu tươi được sấy ở 60oC cho đến khi khối lượng không đổi.
Chlorophyll (nmol/cm2): được xác định bằng máy đo SPAD-502 (Minolta Co., Ltd., Nhật Bản). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.3. Phương pháp quan sát bề mặt mô sẹo
Phương pháp quan sát bề mặt mẫu mô sẹo có khả năng phát sinh phôi cây sâm Ngọc Linh được tiến hành theo các bước sau: (1) Mẫu được cố định trong dung dịch glutaraldehyte 2,5% trong 1 giờ ở 4oC; rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate 0,1M (5 phút/lần, 3 lần); (2) Cố định lại mẫu bằng dung dịch OSO4 1% trong 15 phút ở nhiệt độ phòng, rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate 0,1M (5 phút/lần, 3 lần). (3) Hút nước bằng cồn các nồng độ 50%, 70%, 80%, 90%, 100% (5 phút/lần, 3 lần); mẫu được để khô ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sau khi đã khô, mẫu được đưa lên đế, phủ màng dẫn điện Platinum - Palladium. Sau đó mẫu được đưa vào buồng mẫu của kính hiển
vi điện tử quét FE SEM S4800 (Hitachi) để quan sát và đọc kết quả [51].
2.3.4. Phương pháp giải phẫu thực vật
Tạo các lát cắt mỏng phôi, ngâm các mẫu đã cắt trong nước Javel 10% trong 15 phút. Rửa sạch mẫu bằng nước cất, tiếp theo ngâm mẫu trong acid acetic 15% trong 15 phút để cố định mẫu. Rửa sạch mẫu bằng nước cất cho đến khi hết mùi acid. Sau đó, ngâm mẫu trong phẩm nhuộm hai màu trong 5 phút; rửa lại mẫu bằng bình phun nhỏ giọt cho đến khi nước trong đĩa petri ngâm mẫu không còn màu phẩm nhuộm. Đặt mẫu lên lam kính, nhỏ lên mẫu một giọt nước cất, đậy lamelle lên và quan sát mẫu dưới kính hiển vi Olympus CH 30 ở vật kính x4 [5].
2.3.5. Phương pháp quan sát và đếm số lượng tế bào
Phương pháp xác định mật độ tế bào trong các bình nuôi cấy theo các bước sau: (1) Huyền phù tế bào cây salem (1 mL) được thu nhận cho vào eppendorf, ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ dịch môi trường; (2) Mẫu sau khi ly tâm được cố định trong paraformaldehyde 4% trong 15 phút, ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ dịch nổi; (3) Dịch tế bào được ủ với triton X100 0,1% trong 30 phút, ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ
phòng để loại bỏ dịch nổi; (4) Các tế bào được thu nhận và nhuộm với thuốc nhuộm acridine orange nồng độ 30 µg/mL trong 30 phút, ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút
ởnhiệt độ phòng để loại bỏ dịch nổi; (5) 5 µL các tế bào được cố định trên lam kính, đậy lamelle lên và quan sát dưới kính hiển vi điện tử huỳnh quang (Olympus PX50) để xác định số lượng tế bào đơn [38].
2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng khí ethylene
Khí trong bình nuôi cấy kín được thu nhận trực tiếp bằng ống tiêm không rò rỉ khí (1 mL) và bơm vào hệ thống GC bằng phương pháp thủ công. Khí ethylene sau đó được định lượng bằng phương pháp sắc ký khí. Một cột thép không gỉ (3 m × 1,5 mm) chứa đầy chất hấp phụ - Porapack P, có kích thước hạt 80 – 100 Mesh đã được sử dụng. Nhiệt độ phát hiện cột, kim phun và ngọn lửa ion hóa lần lượt là 60oC và 90oC. Khí nitơ được sử dụng làm khí mang (55 mL/phút) sẽ đưa khí cần phân tích đến cột sắc ký [50].
2.3.7. Phương pháp xác định hàm lượng AgNPs hấp thụ
Hàm lượng hấp thụ AgNPs trong môi trường nuôi cấy được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) [179]. Môi trường nuôi cấy được thu thập và phân huỷ bằng acid HNO3/HCl, sau đó 5 mL mẫu phân tích được