L ời cam đoan
1.3.Giới thiệu tổng quan về cảm biến sinh học
Thuật ngữ cảm biến sinh học đƣợc Cammann đƣa ra và đƣợc IUPAC giới thiệu. Cảm biến sinh học là một thiết bị phân tích chuyển đổi các phản ứng sinh học thành tín hiệu nhiệt, quang hoặc điện [50]. Một cảm biến sinh học lý tƣởng phải có độ đặc hiệu cao, có thể tái sử dụng và không phụ thuộc vào các yếu tố vật lý (nhƣ độ pH, nhiệt độ, …) [51]. Cảm biến sinh học đƣợc ứng dụng trong nhiều
15
lĩnh vực khác nhau nhƣ: theo dõi bệnh, phát hiện thuốc, phát hiện các chất gây ô nhiễm cũng nhƣ các vi sinh vật gây bệnh [52].
Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học thông thƣờng bao gồm:
Phần tử nhận biết sinh học: Là các thành phần sinh học (Ví dụ: enzim, ADN, kháng thể, …) phản ứng trực tiếp với chất phân tích. Tƣơng tác giữa phần tử nhận biết sinh học với chất phân tích sinh ra tín hiệu đƣợc gọi là nhận dạng sinh học.
Bộ chuyển đổi: Có chức năng chuyển đổi các tín hiệu sinh hoá thành một tín hiệu có thể đo đƣợc. Hầu hết bộ chuyển đổi tạo ra tín hiệu quang, cơ hoặc điện, thƣờng tỷ lệ thuận với tƣơng tác giữa chất phân tích và phần tử nhận biết sinh học.
Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra: Có vai trò xử lý tín hiệu đƣợc chuyển đổi và hiển thị [52].
Hình 1.7 Cấu tạo của cảm biến sinh học
Cảm biến sinh học đƣợc hoạt động dựa trên nguyên lý sau: Khi cảm biến đƣợc tiếp xúc với chất phân tích, sẽ xuất hiện phản ứng giữa chúng và các thành phần sinh học (enzym, tế bào, ADN, …) nếu có sự tƣơng thích sinh học. Do đó, dẫn đến sự thay đổi nồng độ ion, thay đổi nhiệt độ, hoặc thay đổi khối lƣợng, … Nếu chất phân tích và các thành phần sinh học không tƣơng thích thì sẽ không xuất hiện sự thay đổi tín hiệu. Phụ thuộc vào các phƣơng pháp phát hiện khác nhau, ngƣời ta có thể sử dụng các đầu đo và bộ xử lý khác nhau cho việc hiển thị và thu nhận.
Trên thực tế, ngƣời ta phân loại cảm biến sinh học theo nhiều cách khác nhau. Nếu dựa vào các phẩn tử sinh học thì có thể phân loại thành cảm biến ADN, cảm biến enzym, cảm biến kháng thể, … Nếu dựa vào bộ chuyển đổi tín hiệu thì có thể chia thành cảm biến điện, cảm biến nhiệt, cảm biến quang, cảm biến cơ.
Phần tử nhận biếtsinhhọc
Chấtphân tích
Bộ chuyển đổi
16
Trong đó, cảm biến sinh học sử dụng bộ chuyển đổi tín hiệu điện hóa nhận đƣợc nhiều sự quan tâm nghiên cứu đến từ các nhà khoa học trên thế giới do cấu trúc đơn giản, nhỏ gọn và cho độ nhạy cao. Bộ chuyển đổi này dựa vào sự thay đổi tín hiệu sinh hóa từ các tƣơng tác giữa các thành phần sinh học với chất phân tích, các tín hiệu này đƣợc thu lại thông qua bộ chuyển đổi và xử lý để hiển thị tín hiệu ra [50].
1.3.2. Ứng dụng của cảm biến sinh học a) Trong môi trƣờng a) Trong môi trƣờng
Cảm biến sinh học đƣợc xem là một trong số các thiết bị nhỏ gọn, tiện lợi, chi phí thấp, kết quả tin cậy trong việc phát hiện và chẩn đoán các chất gây ô nhiễm trong môi trƣờng. Christophe Vedrine và cộng sự [53] đã thiết kế một cảm biến quang học để xác định chất diệt cỏ gây ô nhiễm thủy sinh. Sara Rodriguez- Mozaz và cộng sự [54] đã phát triển cảm biến để xác định thuốc trừ sâu, hóa chất gây rối loạn nội tiết thay thế cho các kỹ thuật sắc ký truyền thống. Lawrence Stiner và cộng sự [55] đã chế tạo một cảm biến sinh học có khả năng đo benzen, toluen, ethylbenzen và các hợp chất của chúng trong dung dịch nƣớc. Donatella Albanese và cộng sự [56] đã phát triển cảm biến sinh học nitrat có thể xác định sự có mặt của ion nitrat trong mẫu nƣớc. Feng Long cùng cộng sự [57] đã chế tạo cảm biến để phát hiện nhanh ion kim loại thủy ngân. R. Ilangovan và cộng sự [58] đã nghiên cứu chế tạo cảm biến phát hiện các kim loại nặng khác nhƣ cadmi, chì và đồng.
b) Trong chế biến và an toàn thực phẩm
Bên cạnh đó, các vấn đề về chất lƣợng và an toàn thực phẩm cũng đƣợc quan tâm, trong đó các phƣơng pháp truyền thống nhƣ các phép đo quang phổ thƣờng tốn kém và mất thời gian. Do đó, việc ứng dụng cảm biến sinh học vào ngành công nghiệp này mang nhiều ƣu điểm nhƣ đơn giản, cho kết quả nhanh, đáng tin cậy, có chọn lọc và tiết kiệm chi phí. Ozlem Torun và cộng sự [59] đã nghiên cứu phát triển cảm biến dựa trên phổ cộng hƣởng plasmon bề mặt nhằm xác định tế bào vi khuẩn Escherichia coli một cách nhanh chóng, chính xác. Hay một ví dụ khác, nhóm nghiên cứu của Mahdi Ghasemi-Varnamkhasti [60] đã phát triển cảm biến enzym nhằm đánh giá hạn dùng của bia bằng phép đo quét thế vòng và đã chứng tỏ khả năng phân loại các loại bia theo hạn sử dụng của chúng. Xia Liu và cộng sự [61] đã phát triển cảm biến nhằm phát hiện thuốc diệt cỏ atrazine dựa trên hạt nano vàng, kết quả cho thấy cảm biến có độ ổn định và khả năng tái tạo tốt, do đó có thể đƣợc áp dụng để phân tích thuốc trừ sâu khác trên các mẫu cây trồng.
c) Trong y sinh
Bên cạnh đó, một ứng dụng khá nổi bật của cảm biến sinh học là dùng để chẩn đoán bệnh trong y tế. Trên thế giới, đã có nhiều công trình công bố về kết quả đạt đƣợc trong nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học trong y sinh. Jingyun Jiang và cộng sự đã nghiên cứu chế tạo cảm biến glucose phi enzym từ các hạt
17
nano đồng đƣợc lắng đọng bằng phƣơng pháp điện hóa trên điện cực nano graphene với giới hạn phát hiện là 0.12 µM, độ nhạy 20.6 µA/mM [62]. Một công trình khác liên quan đến cảm biến glucose đến từ nhóm của Shuo Wang, cảm biến đƣợc chế tạo bằng phƣơng pháp điện hóa từ các hạt nano đồng có giới hạn phát hiện là 1.39 µM [63]. Nhóm nghiên cứu của Harshala J. Parab đã chế tạo cảm biến AND từ thanh nano vàng có thể phát hiện vi rút mầm bệnh Chlamydia trong khoảng nồng độ 0,25 – 20 nM với khả năng phân biệt với các gen gây bệnh khác [64]. Cảm biến cholesterol đƣợc chế tạo bởi nhóm của Anees A. Ansari từ màng xốp CeO2 trong khoảng nồng độ cholesterol 10 – 400 mg/dl [65]. Ali và các cộng sự đã phát triển cảm biến ADN điện hoá trên cơ sở AuNPs và graphene ô xít (RGO) để phát hiện ung thƣ vú. Họ đã chứng minh việc kết hợp AuNPs và RGO đã làm nâng cao độ nhạy của cảm biến. Trong điều kiện phát hiện tối ƣu, cảm biến có giới hạn phát hiện thấp nhất là 10-20 M [66]. Feng Long và cộng sự đã chế tạo cấu trúc nano composit Cu2O/Au để nhận biết galectin-1 trong khoảng nồng độ từ 0.1 pg/ml đến 10 ng/ml [67]. Nhóm của Vjaceslavs Gerbreders đã tổng hợp các cấu trúc của ZnO nhƣ màng mỏng ZnO, thanh nano ZnO và ống nano ZnO bằng các phƣơng pháp khác nhau. Cảm biến ADN của Trichinella britovi- một loại ký sinh trùng gây ra bệnh truyền nhiễm từ động vật sang ngƣời- trên cơ sở các cấu trúc khác nhau của ZnO đƣợc tiến hành phân tích, kết quả cho thấy, ống nano ZnO cho độ nhạy tốt nhất [68]. Hay công trình của Bhaskar S. Vadlamani và cộng sự [69] phát triển cảm biến dùng để phát hiện nhanh SARS-CoV-2. Cảm biến trên cơ sở ống nano TiO2 đƣợc chức năng hóa Co, cho phép phát hiện protein SARS COV-2 S-RBD (receptor binding domain) trong khoảng nồng độ 14 to 1400 nM với giới hạn phát hiện là 0.7 nM.
1.3.3. Cảm biến ADN
ADN (axit deoxyribo nucleic) là một chuỗi xoắn kép của hai mạch polinucleotit (single-stranded ADN- ssADN). Mỗi nucleotit đƣợc cấu tạo bởi một phân tử đƣờng deoxyribo liên kết với một nhóm photphat và một trong bốn bazơ nitơ A (Adenine), T (Thymine), G (Guanine) và C (Cytosine) bằng các liên kết hóa học. Trong một nucleotit, nhóm photphat liên kết với phân tử đƣờng bằng liên kết hóa trị este-photphat, phân tử đƣờng liên kết với bazơ nitơ bằng liên kết glycozit. Các nucleotit liên kết với nhau bằng liên kết hóa trị giữa phân tử đƣờng của nucleotit đứng trƣớc với nhóm photphat của nucleotit đứng sau. Các chuỗi polinucleotit liên kết với nhau bằng liên kết hydro giữa các cặp bazo nito theo nguyên tắc bổ sung: A-T bằng hai liên kết hydro, G-C bằng ba liên kết hydro và ngƣợc lại để tạo thành chuỗi ADN mạch kép (double-stranded ADN- dsADN) [70].
18
Hình 1.8 Cấu tạo của một nucleotit và các bazơ nitơ[70]
Chuỗi xoắn kép trong dsADN có thể tách ra thành hai mạch đơn ssADN khi ở nhiệt độ cao. Ngƣời ta đƣa vào khái niệm nhiệt độ nóng chảy của ADN là nhiệt độ mà tại đó có khoảng 50% chuỗi dsADN biến đổi thành ssADN [71]. Điểm nóng chảy này đặc trƣng cho các chuỗi dsADN, phụ thuộc vào số lƣợng liên kết G-C và A-T. Do liên kết A-T chỉ bằng 2 liên kết hydro, G-C bằng 3 liên kết hydro, nên chuỗi dsADN có số lƣợng liên kết A-T càng nhiều thì nhiệt độ nóng chảy càng thấp và ngƣợc lại [71]. Khi các cặp bazơ nitơ tách rời nhau, các ssADN sẽ tách rời và tồn tại độc lập trong dung dịch. Khi hạ dần nhiệt độ, các ssADN sẽ liên kết lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung tạo thành các dsADN ban đầu.
ADN có tính đặc thù và tính đa dạng. Tức là số lƣợng, trình tự sắp xếp các nucleotit là đặc trƣng cho từng loài và nếu thay đổi thì sẽ tạo ra các ADN khác nhau. Do vậy, cảm biến sinh học ADN đƣợc phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây. Chúng có ý nghĩa và giá trị lớn trong các nghiên cứu biểu hiện gen, định dạng gen, dƣợc lí học, xác định trình tự và chẩn đoán phân tử [72].
Cảm biến ADN hoạt động dựa trên việc phát hiện sự lai hóa của các chuỗi ssADN. Bề mặt cảm biến đã cố định các ssADN dò đƣợc nhúng vào dung dịch chứa các ssADN đích. Khi có sự bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung của các bazơ nitơ A-T, G-C của chuỗi ssADN dò và ssADN đích, một chuỗi dsADN hình thành trên bề mặt cảm biến [72]. Quá trình cố định các ssADN dò và lai hóa đƣợc phát hiện dựa trên sự thay đổi của tín hiệu dòng điện trên bề mặt điện cực thông qua các phép đo điện hóa. Nguyên lý hoạt động của cảm biến ADN đƣợc trình bày nhƣ hình 1.9.
19 Hình 1.9 Nguyên lí cảm biến ADN [72] ssADN dò ssADNđích ssADN khôngbắt cặp Điện cực Chấtphân tích (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
20
CHƢƠNG 2.PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.1. Phƣơng pháp thực nghiệm
Quy trình thực nghiệm đƣợc mô tả nhƣ ở hình 2.1. Sau khi tổng hợp DES và dung dịch chất điện ly, các phức chất có trong dung dịch đƣợc khảo sát thông qua phép đo hấp thụ UV-Vis-NIR. Quá trình điện phân và cơ chế đƣợc nghiên cứu thông qua phƣơng pháp quét thế tuần hoàn và quét thế tĩnh. Hình thái bề mặt, thành phần và cấu trúc của lớp điện phân đƣợc khảo sát thông qua các phép đo FESEM, EDS, XRD. Sau đó, mẫu lắng đọng đồng trên điện cực đƣợc ứng dụng trong cảm biến ADN.
Hình 2.1 Tóm tắt quá trình nghiên cứu
Các hóa chất đƣợc dùng cho các thí nghiệm đƣợc trình bày trong bảng 3:
Bảng 3: Danh mục hóa chất và thiết bị được sử dụng
TT Hóa chất và thiết bị 1 C5H14ClNO (ChCl) 2 H2NCONH2 (U-rê) DES CuCl2.2H2O Hấp thụUV-Vis Pt Pt Cu Pt Si Pt Cu O (Pt) (Pt) (Pt) (2 2 0 ) (2 0 0 ) (1 1 1 ) SEM EDS XRD Cảm biếnADN Quétthế tĩnh
21 3 CuCl2.2H2O 4 K3[Fe(CN)6] 5 K4[Fe(CN)6]
6 KCl
7 Cân tiểu li, thìa lấy hóa chất, giấy cân 8 Máy khuấy từ gia nhiệt, con từ
9 Tủ sấy hóa chất 10 Micro pipet
2.1.1. Tổng hợp dung dịch chất điện li
Trong luận văn này, phƣơng pháp điện hóa đƣợc sử dụng để tổng hợp vật liệu nano đồng trong dung môi eutectic sâu.
Hóa chất đƣợc dung để tổng hợp dung môi là ChCl và U-rê. Quy trình tổng hợp đƣợc mô tả dƣới hình 2.2. Đầu tiên, cân ChCl và U-rê với tỉ lệ mol 1: 2 rồi trộn đều với nhau. Sau đó đem hỗn hợp trên khuấy và gia nhiệt ở 120 ℃ trong vòng 8 h. Kết quả thu đƣợc là một chất lỏng đồng nhất, trong suốt. Đây chính là dung môi DES.
Hình 2.2 Quy trình tổng hợp dung môi từ ChCl - U-rê
Sấykhô Trộn đều
Khuấy~ 8h
120oC
22
Tiếp theo, muối CuCl2.2H2O đƣợc cho vào dung môi DES vừa tạo thành. Tiếp tục khuấy hỗn hợp ở 100 ℃ trong 6 h để đảm bảo muối tan hết trong dung môi, ta thu đƣợc dung dịch chất điện ly nhƣ ở hình 2.3.
Hình 2.3 Quy trình tổng hợp dung dịch chất điện ly
2.1.2. Tổng hợp hạt kim loại đồng
Trong luận văn này, hạt kim loại đồng đƣợc tổng hợp trên bề mặt điện cực platin trong dung dịch chứa 50 mM CuCl2.2H2O trong DES ở 80 ℃ thông qua kỹ thuật quét thế tĩnh (sẽ đƣợc trình bày dƣới đây). Sau khi tổng hợp xong, điện cực đƣợc rửa bằng nƣớc khử ion rồi để khô tự nhiên nhằm loại bỏ phần dung dịch bám trên bề mặt điện cực.
2.1.3. Cốđịnh chuỗi ADN trên bề mặt cảm biến
Phƣơng pháp hấp phụ đƣợc xem là phƣơng pháp đơn giản nhất dùng để cố định chuỗi ADN dò trên bề mặt cảm biến. Phƣơng pháp này dựa trên các lực nhƣ tƣơng tác Van der Walls, liên kết tĩnh điện và liên kết hydro. Các ADN liên kết với kim loại theo định hƣớng ngẫu nhiên trên bề mặt vì mỗi phân tử có thể hình thành nhiều điểm tiếp xúc khác nhau [73]. Farrokhpour và cộng sự [74] đã chỉ ra rằng có sự lai hóa mạnh mẽ giữa một vài orbital nguyên tử của các bazo nito và orbital d của các nguyên tử đồng. Các orbital nguyên tử này có liên quan đến các tƣơng tác và sự chuyển đổi điện tích của các bazo nito và các nguyên tử đồng. Báo cáo này cũng xác định bản chất của tƣơng tác giữa các bazo nito và nguyên từ đồng, cụ thể nhƣ sau, nguyên tử tƣơng tác nhiều nhất với bề mặt Cu của Adenine là N trong nhóm NH2, của Cytosine và Guanine là nguyên tử O của nhóm cacbonyl, đối với Thymine, nguyên tử O và N có tƣơng tác cao hơn đối với những nguyên tử còn lại.
23
Điện cực sau khi đã lắng đọng hạt kim loại đồng đƣợc nhúng trong một dung dịch có chứa chuỗi ADN dò. Sau đó, đƣợc rửa với nƣớc khử ion để loại bỏ những chuỗi ADN không liên kết với bề mặt cảm biến. Để lai hóa ADN, cảm biến đã cố định ADN dò tiếp tục đƣợc nhúng trong dung dịch chứa chuỗi ADN đích.
Đoạn phân tử ADN đƣợc sử dụng là của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis. Trong đó, chuỗi dò và chuỗi đích có cấu trúc nhƣ sau:
ADN dò (ssDNA): 5’-GGTCTTCGTGGCCGGCGTTCA-3’ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ADN đích: 3’-CCAGAAGCACCGGCCGCAAGT-5’
Các phép đo kiểm tra ADN cố định và lai hóa đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp điện hóa trong dung dịch chứa 5mM [Fe(CN)6]3-/4- và 100 mM KCl pha trong nƣớc khử ion.
2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phƣơng pháp điện hóa
Hệ điện hóa sử dụng là hệ điện hóa ba điện cực (điện cực làm việc, điện cực so sánh và điện cực đối).
Hình 2.4 Hệđiện cực được sử dụng trong luận văn
Trong đó, điện cực làm việc (Working electrode - WE) là nơi xảy ra các phản ứng điện hóa cần quan tâm. WE cần đƣợc làm từ các vật liệu dẫn điện và thƣờng đƣợc làm từ các-bon hoặc kim loại. Điện cực so sánh (Reference electrode - RE) có điện thế xác định và ổn định. Điện thế trên RE cố định tại một giá trị đƣợc xác định rõ bằng phản ứng oxy hóa khử điện hóa. Để làm đƣợc điều này, RE thƣờng chứa nồng độ không đổi (đệm hoặc bão hòa) của mỗi thành phần tham gia các phản ứng oxy hóa khử. Thông thƣờng RE đƣợc sử dụng là Ag/ AgCl/ KCl bão hòa. Điện cực đối (Counter electrode - CE) có tác dụng đóng kín mạch điện. Khi