Để dễ dàng cho việc lưu giữ và giải trình tự gen, sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR được gắn vào vector tách dòng pCR2.1, biến nạp vào tế bào E.coli chủng Top
F’. Các plasmid tái tổ hợp mang các đoạn gen khuếch đại từ hệ gen chủng Hanvet1.vn nhược độc và 02HY cường độc được sàng lọc và kiểm tra bằng cắt với enzyme hạn chế EcoRI. Đoạn gen từ plasmid tái tổ hợp sẽ được tách ra khỏi vector với kích thước tương đương sản phẩm PCR đã được gắn vào vector tách dòng. Kết quả kiểm tra các plasmid mang các đoạn gen tái tổ hợp của chủng Hanvet1.vn nhược độc được phản ánh ở Hình 3.7.
Hình 3.7. Sản phẩm cắt các plasmid với enzyme hạn chế EcoRI
Chú thích: M: Marker DNA (DNA ladder Fermentase). Kích thước vector: 3.900 bp. Các đường chạy: 1:
Plasmid gắn đoạn gen 1; 2-3: Plasmid gắn đoạn gen 2 (kích thước đoạn gen lần lượt: 680 bp và 564 bp) ; 4-5: Plasmid gắn đoạn gen 3; 6: Plasmid gắn đoạn gen 4; 7: Plasmid gắn đoạn gen 5; 8-9: Plasmid gắn đoạn gen 6; 10: Plasmid gắn đoạn gen 7; 11: Plasmid gắn đoạn gen 8 (kích thước đoạn gen lần lượt: 687 bp và 551 bp); 12: Plasmid gắn đoạn gen 9; 13: Plasmid gắn đoạn gen 10; 14-15: Plasmid gắn đoạn gen 11; 16-17: Plasmid gắn đoạn gen 12; 18: Plasmid gắn đoạn gen 13; 19: Plasmid gắn đoạn gen 14; 20-21: Plasmid gắn đoạn gen 15
Kết quả trên Hình 3.7 cho thấy, các dòng plasmid đều mang đoạn gen ngoại lai, thể hiện trên bản điện di tạo thành 2 băng rõ rệt, có kích thước tương ứng kích thước của vector và đoạn gen được chèn vào. Tuy nhiên, plasmid ở đường chạy 2, 3 và 11 lại tạo thành 3 đoạn, 1 đoạn có kích thước của vector, 2 đoạn có kích thước khác nhau không tương ứng với kích thước của đoạn gen chèn vào. Điều này có thể giải thích trong đoạn gen chèn vào có vị trí cắt của enzyme EcoRI, vì vậy đoạn gen bị cắt thành hai mảnh nhỏ. Điều này sẽ được kiểm chứng sau khi giải trình tự và phân tích gen.
3.3.3. Kết quả giải mã, phân tích hệ gen chủng Hanvet1.vn nhược độc và 02HY cường độc
Các dòng ADN plasmid được tinh sạch và giải trình tự bằng máy giải trình tự gen tự động (ABI 3100). Dữ liệu kết quả được xử lý và phân tích bằng phần mềm BioEdit, PC/Gene và GenDoc. Sau khi giải mã, lắp ráp và phân tích, thu được hệ gen của chủng Hanvet1.vn nhược độc có kích thước 15.276 bp, với 3306 A, 4036 C, 3995 G và 3939 T, tỷ lệ A+T chiếm 47,42%, G+C chiếm 52,68%.
Phần không dịch mã đầu 5’ có độ dài 185 nucleotide (1-185), phần không dịch mã đầu 3’ có độ dài 110 nucleotide (15167-15276). Trình tự gen được đăng ký trên ngân hàng Genbank với mã số KU842720 (Bảng PL 3.1).
Sau khi dịch mã, toàn bộ hệ gen chủng giống gốc Hanvet1.vn nhược độc có 8 khung đọc, mã hóa cho 8 protein:
Khung đọc ORF1a có độ dài 7422 nucleotide (186-7607) mã hóa cho protein không cấu trúc NSP1a với độ dài 2473 axit amin.
Khung đọc ORF1b có độ dài 4380 nucleotide (7598-11977) mã hóa cho protein không cấu trúc NSP1b có độ dài 1459 axit amin.
Khung đọc ORF2 có độ dài 771 nucleotide (11979-12749) mã hóa cho protein GP2 có độ dài 256 axit amin.
Khung đọc ORF3 có độ dài 765 nucleotide (12602-13366) mã hóa cho protein GP3 có độ dài 254 axit amin.
Khung đọc ORF4 có độ dài 534 nucleotide (13147-13683) mã hóa cho protein GP4 có độ dài 178 axit amin.
Khung đọc ORF5 có độ dài 600 nucleotide (13694-14296) mã hóa cho protein GP5 có độ dài 200 axit amin.
Khung đọc ORF6 có độ dài 522 nucleotide (14281-14805) mã hóa cho protein MP có độ dài 174 axit amin.
Khung đọc ORF7 có độ dài 372 nucleotide (14795-15166) mã hóa cho protein NP có độ dài 123 axit amin.
Tương tự như ở chủng Hanvet1.vn nhược độc, hệ gen chủng 02HY cường độc cũng được giải mã, lắp ráp và phân tích nhằm so sánh sự biến đổi của các gen trong toàn bộ hệ gen của chủng nhược độc so với chủng cường độc. Sau khi giải mã, lắp ráp và phân tích, thu được hệ gen của chủng 02HY cường độc có kích thước 15.262 bp, với 3.314 A, 4.033 C, 3.988 G và 3.927 T, tỷ lệ A+T chiếm 47,45%, G+C chiếm 52,55%.
Phần không dịch mã đầu 5’ có độ dài 129 nucleotide (1-129), phần không dịch mã đầu 3’ có độ dài 152 nucleotide (15.111-15.262). Trình tự gen đã được gửi đăng ký trên ngân hàng Genbank với số gửi đăng Submission 2490633 (Bảng PL 3.2).
Sau khi dịch mã, toàn bộ hệ gen chủng 02HY cường độc cũng có 8 khung đọc, mã hóa cho 8 protein:
Khung đọc ORF1a có độ dài 7.422 nucleotide (130-7551) mã hóa cho protein không cấu trúc NSP1a với độ dài 2.473 axit amin.
Khung đọc ORF1b có độ dài 4.380 nucleotide (7542-11921) mã hóa cho protein không cấu trúc NSP1b có độ dài 1.459 axit amin.
Khung đọc ORF2 có độ dài 771 nucleotide (11923-12693) mã hóa cho protein GP2 có độ dài 256 axit amin.
Khung đọc ORF3 có độ dài 765 nucleotide (12546-13310) mã hóa cho protein GP3 có độ dài 254 axit amin.
Khung đọc ORF4 có độ dài 534 nucleotide (13091-13627) mã hóa cho protein GP4 có độ dài 178 axit amin.
Khung đọc ORF5 có độ dài 600 nucleotide (13638-14240) mã hóa cho protein GP5 có độ dài 200 axit amin.
Khung đọc ORF6 có độ dài 522 nucleotide (14225-14749) mã hóa cho protein MP có độ dài 174 axit amin.
Khung đọc ORF7 có độ dài 372 nucleotide (14739-15110) mã hóa cho protein NP có độ dài 123 axit amin.
Như vậy, độ dài của các khung đọc mở từ ORF1a đến ORF7 mã hóa cho 8 protein khác nhau của chủng Hanvet1.vn nhược độc là không đổi so với chủng 02HYcường độc. Điều đó cho thấy không có đột biến thêm đoạn và mất đoạn (Indel) trong các khung đọc này. Câu hỏi đặt ra: Có các đột biến điểm xảy ra trong các khung đọc mở của chủng nhược độc so với chủng cường độc sau quá trình cấy truyền liên tiếp 80 đời trên môi trường tế bào Marc 145 hay không?. Để trả lời cho câu hỏi này việc phân tích, so sánh trình tự nucleotide của các gen ORF và trình tự axit amin của các protein được dịch mã từ các gen ORF đã được tiếp tục tiến hành. Kết quả được tổng hợp ở Bảng 3.11 và Phụ lục Bảng PL3.2; PL3.3; PL3.4; PL3.5; PL3.6; PL3.7; PL3.8; PL3.9.
Bảng 3.11. Mức độ tương đồng trình tự nucleotide và axit amin chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc so với chủng virus PRRS 02HY cường độc
Tương đồng nucleotide giữa
2 chủng (%)
ORF1a ORF1b ORF2 ORF3 ORF4 ORF5 ORF6 ORF7
99,39 99,47 98,83 99,48 99,26 99,67 100,0 99,46
Tương đồng axit amin giữa
2 chủng (%)
NSP1a NSP1b GP2 GP3 GP4 GP5 MP MP
Khung đọc ORF1a mã hóa cho protein không cấu trúc NSP1a có tỉ lệ tương đồng giữa 2 chủng về nucleotide là 99,39% có sai khác 45 nucleotide, về axit amin là 98,99% có sai khác 25 axit amin.
Khung đọc ORF1b mã hóa cho protein không cấu trúc NSP1b có tỉ lệ tương đồng giữa 2 chủng về nucleotide là 99,47% có sai khác 23 nucleotide, về axit amin là 99,25%, có sai khác 11 axit amin.
Khung đọc ORF2 mã hóa cho protein GP2 có tỉ lệ tương đồng giữa 2 chủng về nucleotide là 98,83 % có sai khác 9 nucleotide, về axit amin là 97,66%, có sai khác 6 axit amin.
Khung đọc ORF3 mã hóa cho protein GP3 có tỉ lệ tương đồng giữa 2 chủng về nucleotide là 99,48% có sai khác 4 nucleotide, về axit amin là 98,82%, có sai khác 3 axit amin.
Khung đọc ORF4 mã hóa cho protein GP4 có tỉ lệ tương đồng giữa 2 chủng về nucleotide là 99,26% có sai khác 4 nucleotide, về axit amin là 97,75%, có sai khác 4 axit amin.
Khung đọc ORF5 mã hóa cho protein GP5 có tỉ lệ tương đồng giữa 2 chủng về nucleotide là 99,67% có sai khác 2 nucleotide về axit amin là 99,50%, có sai khác 1 axit amin.
Khung đọc ORF6 mã hóa cho protein MP có tỉ lệ tương đồng axit amin giữa 2 chủng đạt 100%.
Khung đọc ORF7 mã hóa cho protein NP có tỉ lệ tương đồng giữa 2 chủng về nucleotide là 99,46% có sai khác 2 nucleotide, về axit amin là 99,19%, có sai khác 1 axit amin. Chủng Hanvet1.vn nhược độc có 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin nằm rải rác trong 7 gen ORF mã hóa cho 7 protein tương ứng, trong đó protein NP do gen ORF6 mã hóa không có sự biến đổi axit amin. Kết quả nghiên cứu này có sự khác biệt về vị trí và số lượng đột biến về nucleotide gen ORF5 và axit amin của protein GP5 khi so với Leng et al,. 2012 và Yu et al,.2015, Trịnh Đình Thâu và cs, 2018.
Hình 3.8. So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 chủng Hanvet1.vn nhược độc với chủng 02HY cường độc
Chủng Hanvet1.vn xuất hiện 2 đột biến điểm tại vị trí 471 và 587
Hình 3.9. So sánh trình tự axit amin của protein GP5 chủng Hanvet1.vn nhược độc với của chủng 02HY cường độc
Đột biến câm ở vị trí nucleotide 471 không làm thay đổi axit amin Serin. Đột biến sai khác ở vị trí nucleotide 587 khiến Glutamine (Q) biến đổi thành Leucine (L), tuy nhiên axit amin này nằm ngoài vùng epitope kháng nguyên
Đã có sự biến đổi trong hệ gen làm cho chủng Hanvet1.vn trở thành nhược độc nhưng gen mã hóa protein kháng nguyên GP5 kích thích sinh kháng thể trung hòa ở lợn chỉ biến đổi hai nucleotide ở vị trí 471(A->G) làm cho codon
TCA biến thành TCG. Đây là một đột biến câm vì cả 2 codon này đều mã hóa cho axit amin Serine (S). Đột biến thứ hai ở vị trí 587 (A->T) làm cho Glutamine (Q) biến thành Leucine (L). Tuy nhiên, biến đổi này không thuộc các epitope kháng nguyên GP5. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau khi cấy truyền 80 đời, mặc dù các gen của chủng Hanvet1.vn có biến đổi so với chủng độc lực 02HY làm nó trở thành chủng nhược độc nhưng gen mã hóa protein kháng nguyên GP5 kích thích sinh kháng thể trung hòa trên lợn không thay đổi tính kháng nguyên.
3.3.4. Phân tích so sánh gen chủng Hanvet1.vn nhược độc với các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam và thế giới
Để phân tích các biến đổi di truyền hệ gen chủng Hanvet1.vn nhược độc so với một số chủng cường độc lưu hành ở Việt Nam (07QN), Trung Quốc (07NM) và chủng virus PRRS type Bắc Mỹ chuẩn quốc tế (VR2332) theo công bố của (Feng Yet al., 2008), 3 chủng được chọn để so sánh trình tự axit amin của tất cả 8 khung đọc.
Kết quả so sánh sự tương đồng axit amin được tổng hợp ở Bảng 3.12
Bảng 3.12. Mức độ tương đồng trình tự axit amin các protein chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc so với các chủng virus PRRS tham chiếu trên Genbank
Tỉ lệ (%) tương đồng axit amin các protein chủng PRRSV Hanvet1.vn nhược độc so với 3 chủng 07QN (FJ394029) 07MN (FJ393456) VR2332 (EF536003) Hanvet_NP1a (%) 98,79 98,71 86,25 Hanvet_NP1b (%) 98,77 99,45 96,57 Hanvet_GP2 (%) 96,06 96,88 91,80 Hanvet_GP3 (%) 96,85 99,21 86,61 Hanvet_GP4 (%) 97,75 96,63 90,45 Hanvet_GP5 (%) 100,00 98,00 87,00 Hanvet_MP (%) 100,00 100,00 97,70 Hanvet_NP (%) 99,19 100,00 94,31
Kết quả Bảng 3.12 cho thấy, chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc có protein GP5 tương đồng 100% so với chủng độc lực phân lập ở Quảng Nam Việt Nam 07QN và 98% so với chủng virus PRRS Trung Quốc 07NM. Theo công bố
của (Popescu et al., 2017) thì protein GP5 đóng vai trò quan trọng trong kích thích đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể trung hòa virus PRRS. Chính vì vậy sự tương đồng 100% về trình tự axit amin của protein GP5 chủng Hanvet1.vn nhược độc so với chủng đại diện lưu hành ở Việt Nam 07QN là thông tin quan trọng về sự tương đồng kháng nguyên tạo kháng thể trung hòa chống lại chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam. Tuy nhiên, protein GP5 này có độ tương đồng khá thấp so với chủng VR2332, chỉ đạt 87%. Các protein MP và NP có tính bảo thủ cao so với các chủng độc lực lưu hành ở Việt Nam và Trung Quốc, đều đạt 99-100%. Các protein còn lại đều có sự thay đổi so với chủng độc lực, dao động từ 1,2% ở NP1a đến 3,9% ở GP2. Tuy nhiên, sự tương đồng về trình tự axit amin của tất cả các protein chủng Hanvet1.vn nhược độc đều thấp hơn nhiều nếu so sánh với chủng chuẩn virus PRRS type II (chủng Bắc Mỹ VR2332), dao động từ 86,25% đến 97,7%.
Để đánh giá sự tương đồng về trình tự nucleotide và protein gen mã hóa kháng nguyên GP5 (ORF5) của chủng Hanvet1.vn nhược độc so với các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam. Tiếp tục so sánh trình tự nucleotide và protein gen ORF5 của chủng Hanvet1.vn nhược độc với trình tự ORF5 trên GenBank của các chủng virus PRRS thu nhận từ các tỉnh thành khác nhau của Việt Nam. So sánh trình tự gen và protein được thực hiện bằng chương trình phần mềm BioEdit, sau đó sử dụng chương trình phần mềm MEGA6 để xây dựng cây phả hệ dựa trên thuật toán Neighbor-Joining.
Kết quả trong Hình 3.10 và Bảng phụ lục (PL3.10; PL3.12) phản ánh sự tương đồng về trình tự nucleotide gen mã hóa kháng nguyên GP5 cao nhất là 99% đều thuộc về các chủng virus PRRS lưu hành ở các tỉnh đồng bằng sông Hồng như Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Nam Định, Thái Bình. Độ tương đồng về trình tự nucleotide gen mã hóa kháng nguyên GP5 thấp nhất là 94-96% là các chủng virus PRRS thu nhận từ Yên Bái và Nghệ An.
Sự tương đồng về trình tự axit amin của protein kháng nguyên GP5 chủng chủng Hanvet1.vn nhược độc cao nhất là các chủng thu nhận từ Hưng Yên, Hải Phòng và Hà Nội (đạt 99%); thấp hơn một chút là ở các chủng thu nhận từ Bắc Ninh, Nam Định, Bắc Giang (chủng KTY do học Viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập) và Sơn La (đạt 98%). Kết quả được phản ánh trong Hình 3.11 và Phụ lục (PL 3.11; PL 3.13).
Hình 3.10. Cây phả hệ phản ánh mối quan hệ họ hàng của chủng Hanvet1.vn nhược độc với các chủng virus PRRS lưu hành ở các tỉnh thành khác nhau của Việt Nam
dựa trên trình tự nucleotide gen ORF5
Mối quan hệ họ hàng trên cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự nucleotide gen ORF5 mã hóa kháng nguyên GP5 trên Hình 3.10 và cây phát sinh chủng loài dựa trên trình tự axit amin protein GP5 trên Hình 3.11 và Phụ lục (PL3.11; PL3.13) cho thấy: Chủng Hanvet1.vn nhược độc có quan hệ gần gũi nhất với các chủng virus PRRS thuộc khu vực đồng bằng Sông Hồng.
Hình 3.11. Cây phả hệ phản ánh mối quan hệ họ hàng của chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc với các chủng virus PRRS lưu hành ở các tỉnh thành khác nhau của Việt Nam dựa
trên trình tự axit amin protein GP5
3.4. Đánh giá đặc tính giống gốc chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc
Giống gốc Hanvet1.vn sau khi lấy ra khỏi nơi bảo quản được làm tan hoàn toàn ở nhiệt độ khoảng 20oC-25oC và được đánh giá về cảm quan giống gốc đạt yêu cầu: Môi trường hoàn toàn đồng nhất, không tách lớp, vẩn hay tủa. Giống gốc tiếp tục được kiểm tra đạt vô trùng khi các ống môi trường nuôi cấy không có mặt vi khuẩn và nấm mốc trong suốt thời gian theo dõi từ 7-14 ngày.
3.4.1. Kiểm tra thuần khiết
- Kiểm tra vô trùng
Ba mẫu từ lô giống, mỗi mẫu tiến hành thí nghiệm nuôi cấy trên 2 ống. Kết quả phát hiện vi khuẩn và nấm mốc thể hiện trên Bảng 3.13
Bảng 3.13. Kiểm tra vô trùng giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn MT
Mẫu
Thioglycollat Trypticaza
đậu tương Thạch máu Sabouraud Kết luận
Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2
Mẫu 1 - - - - - - - - Đạt Mẫu 2 - - - - - - - - Đạt Mẫu 3 - - - - - - - - Đạt
Ghi chú: (-) là trên môi trường kiểm tra không có vi khuẩn và nấm mọc (Âm tính)
Kết quả thí nghiệm cho thấy: Các ống môi trường nuôi cấy không xuất hiện các hiện tượng môi trường vẩn đục hay lắng cặn, trên bề mặt thạch không xuất hiện nấm, khuẩn lạc mọc lên. Như vậy, giống gốc Hanvet1.vn nhược độc không bị tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc, giống gốc đạt chỉ tiêu vô trùng.
- Kiểm tra virus ngoại lai
Giống gốc được kiểm tra xác định có hay không sự tạp nhiễm với một số virus, vi khuẩn gây bệnh ở lợn thường có triệu chứng và bệnh tích tương tự, dễ nhầm lẫn với PRRS là: Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), Transmissible gastroenteritis virus (TGEV), Classical swine fever virus (CSFV), Porcine circovirus type 2 (PCV2), Porcine parvovirus (PPV).
(A) (B)
Hình 3.12. Điện di kiểm tra giống Hanvet1.vn tạp nhiễm với một số loại virus
Chú thích: Hình (A,B): (-) đối chứng âm của phản ứng PCR/RT PCR, M: Marker.
Các đường chạy: (a, b, c, d, e) lần lượt là cDNA dương chuẩn (PEDV; TGEV; CSFV); DNA dương chuẩn (PCV2; PPV). Ký hiệu 1, 2 tương ứng với 2 lô giống gốc.
Kết quả Hình 3.12, ở các mẫu đối chứng dương đều cho vạch đặc hiệu có kích thước như thiết kế (PEDV: 654 bp, TGEV: 858 bp, CSFV: 774 bp, PCV2: 354