Sau khi cây sói rừng đem về sẽ tiến hành đo kích thước như chiều cao cây, kích thước trung bình của rễ, cuống lá, phiến lá, hoa, quả ,….
Trình tự nucleotide sau khi giải trình tự sẽ được xử lý bằng các phần mềm bioedit, BLAST, DNAstar. Lập bảng biểu, nhập các số liệu sau đó đưa ra nhận xét, phân tích và rút ra kết luận.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm thực vật học của cây sói rừng thu tại Lạng Sơn
Sói rừng là cây bụi thường xanh, cao 1 - 2m, có bộ rễ phát triển, dễ chính dài khoảng 25- 30 cm, đường kính khoảng 0,5 - 1cm, có nhiều rễ con phát triển, có mầu nâu vàng, rễ cứng.
Cây Sói rừng có thân gỗ, nhánh tròn, không có lông, thân có màu xanh đậm, các mấu hơi phồng ra, phần thân non có mầu xanh, phần thân già có màu hơi đỏ tía. Mặt cắt ngang có hình tròn, đường kính thân khoảng 0,5 - 1,5 cm. Lá đơn mọc đối, phiến lá có hình elip, hình trứng
Hình 3.1. Mẫu cây sói rừng thu thập tại
Lạng sơn
ngược hoặc elip hẹp đến thuôn, chóp lá nhọn, dài 7 - 20cm, rộng 3 - 5cm, gốc thon nhọn, mép lá có răng cưa nhọn và thô, phần không xẻ gần cuống dài 3 - 3,2cm, gân lông chim, gân chính nổi rõ với 5 - 7 cặp gân nhọn, gân bên hình cung mờ, gân lồi mặt dưới, cuống ngắn 5 - 10mm. Lá nhẵn, không có lông, mặt trên có mầu xanh sẫm, mặt dưới nhạt. Bông kép, ít nhánh, nhánh ngắn. Cụm hoa có mầu xanh nhạt hoặc trắng, dài 3 - 8cm, bông khá dày, dài 1 - 3,5cm. Hoa cái nhỏ, màu trắng, dạng phích hoặc dạng cầu méo, dài 1 - 1,5mm, không cuống và có một nhị.
Hình 3.2. Các bộ phận của cây sói rừng
1 - Rễ; 2 - thân ; 3 - Lá; 4 - Cách sắp xếp lá; 5 - Hoa; 6 - cành mang quả; 7- Quả
Marker DNA tổng số
DNA tổng số
Theo một số nghiên cứu về đặc điểm hình thái của cây sói rừng đã được tiến hành nghiên cứu trước đó, Sói rừng có bầu nhụy hình trứng và không có vòi, hóa đực dài 1,3 - 2mm, rộng 1 - 1,3 mm, bao phấn kéo dài từ một nửa đến toàn bộ chiều dài. Cây sói rừng có quả nhỏ, mọng, hình gần tròn đường kính 4 - 7 mm. Quả ban đầu xanh, khi chín có màu đỏ hay đỏ gạch, hạt không mở màu vàng hoặc kem [10]. Cây thường mọc ở vùng núi đất, ở bìa rừng, ven đồi ẩm, sườn núi, các khu đầm lầy, đồng cỏ, ven suối. Cây có hoa vào tháng 6 - 7, quả tháng 8 - 9.
Phân bố: Ở Việt Nam cây mọc từ Hà Giang (Vị Xuyên), Sơn La (Mộc Châu), Cao Bằng (Thạch An, Nguyên Bình, Tĩnh Túc), Lạng Sơn (Hữu Lũng, Bắc Sơn), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội (Hà Tây), Thừa Thiên Huế, Kom Tum ( Đác lây, KonPlong), Lâm Đồng (Đà Lạt, Bảo Lộc). Trên Thế giới, cây có ở Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên, Malaysia, Indonesia, Lào, Thái Lan, Hàn Quốc.
3.2. Phân lập gen từ mẫu cây sói rừng
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số
Để tách được DNA từ mẫu lá của cây sói rừng có chất lượng tốt và đáp ứng các mục đích thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp dùng CTAB (Collins và Symons, 1992) [17] với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm (mục 2.2.2.1). Kết quả điện di (Hình 3.3) cho thấy DNA thu được có đủ số lượng và chất lượng cần thiết, các vạch điện di rõ gọn không bị đứt gãy, ít thấy các vết protein và tạp chất còn dư trong mẫu, đảm bảo chất lượng cho phản ứng nhân gen tiếp theo.
Trong tách chiết DNA tổng số từ thực vật,
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số cây Sói rừng trên gel agarose 1%
có nhiều phương pháp khác nhau đã được ứng dụng, trong đó phương pháp dùng CTAB có ưu điểm là khá đơn giản, tiết kiệm thời gian mà DNA thu được vẫn đảm bảo chất lượng. Đã có nhiều cải tiến trong quy trình tách chiết DNA sử dụng CTAB tỏ ra đặc biệt hiệu quả trong đó với cả các mẫu mô thực vật chứa nhiều polysaccharid và polyphenol (Porebski và cộng sự, 1997) [28]. Hiện nay, phương pháp dùng CTAB để tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô thực vật được sử dụng phổ biến trong các công trình nghiên cứu.
Để xác định hàm lượng và độ tinh sạch, DNA tổng số đươc đo mật độ quang phổ (OD) ở bước sóng 260nm và 280nm. Kết quả đo được tỉ số A260/280 = 1,95 tương đương với hàm lượng mẫu bằng 191,3 µg/µl. Kết quả đo OD cho thấy mẫu DNA đủ độ tinh sạch để thực hiện phản ứng PCR ( tỉ số A260/280 trong khoảng từ 1,5 - 2, 0)
3.2.2. Khuếch đại vùng gen nghiên cứu bằng phản ứng PCR
Khuếch đại đoạn gen là công đoạn đầu tiên nhằm nhân lên các đoạn DNA chỉ thị mong muốn sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. Trong nhiều công bố gần đây về sử dụng DNA barcode, các tác giả cho thấy việc nhân bản thành công các trình tự DNA barcode bằng phản ứng PCR phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng DNA dùng làm khuôn và đặc biệt là nhiệt độ bắt mồi đặc hiệu (Yonghua Li và cộng sự, 2010) [36].
rpoC1 là một trong những gen cơ bản trong việc nghiên cứu sự phát
sinh loài, đã được sử dụng ở nhiều nhóm sinh vật khác nhau còn ITS là gen
nhân được sử dụng nhiều trong phân tích đa dạng và xác định loài ở thực vật. Để khuếch đại được đoạn gen rpoC1 và ITS chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu như đã trình bày ở bảng 2.4. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR như ở mục 2.2.2.3.
bp 750 500 250 650 B bp 750 500 250 550 A
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 (A) và sản phẩm nhân
bản vùng ITS (B) từ các cặp mồi đặc hiệu M. Maker 1kb; 1. Sản phẩm PCR nhân gen
Kết quả nhân bản gen ITS và rpoC1 cây sói rừng ở Hình 3.4 cho thấy
vùng ITS có kích thước khoảng 650bp, gen rpoC1 có kích thước khoảng
550bp đúng như kích thước dự đoán ban đầu. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy băng vạch sáng rõ nét và chỉ có một băng duy nhất điều này chứng tỏ quá trình nhân bản vùng ITS và gen rpoC1 có kết quả
tốt ở mẫu sói rừng nghiên cứu. Do đó, sản phẩm này được chúng tôi sử dụng cho tách dòng và giải trình tự.
Sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen còn có lẫn các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide,... và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình tách dòng, do vậy cần tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tiến hành quá trình đưa gen vào vector tách dòng. Việc tinh sạch được thực hiện bằng bộ Kit AccuPrep Gel Purification Kit. Nguyên lý của phản ứng và quy trình thực hiện được nêu ở mục 2.2.2.4. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên
gel agarose 1% để kiểm tra chất lượng và xác định sơ bộ hàm lượng DNA tinh sạch.
3.2.3. Kết quả ghép nối gen vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch, chạy điện di kiểm tra và tính toán hàm lượng DNA để dùng cho phản ứng ghép nối vào vector tách dòng pBT. Phản ứng ghép nối là phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa base Adenin ở đầu 5’ của sản phẩm PCR với base Thymine ở đầu 3’ của vector tách dòng nhờ hoạt tính nối của enzyme T4 ligase. Nguyên lý và kỹ thuật ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng được trình bày cụ thể ở mục
2.2.2.5. Kết quả của phản ứng ghép nối sẽ được thể hiện sau khi biến nạp vào tế bào khả biến E. coli.
Sản phẩm của quá trình chuyển gen vào vector pBT sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α, sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung carbenicilin 50 mg/l, X-gal 40 µl/ml và IPTG 100μM. Kết quả của quá trình này sẽ là sự xuất hiện của những khuẩn lạc xanh và trắng, trong đó khuẩn lạc trắng là những khuẩn lạc chúng ta quan tâm.
Hình 3.5. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp gen rpoC1 vào tế bào khả biến
Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đều đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh carbenicillin nên có thể phát triển được trên môi trường chọn lọc này và phát triển thành các khuẩn lạc. Những khuẩn lạc xanh xuất hiện là do vector không có nhận được gen ngoại lai. Do vector có mang operon lacZ nên khi operon này hoạt động bình thường và khi có mặt chất
cảm ứng IPTG sẽ tổng hợp enzyme β- galactosidase, enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng là do nhận được plasmid mang gen ngoại lai. Gen ngoại lai sẽ chèn vào và nó sẽ phá vỡ cấu trúc gen lacZ khi có chất cảm ứng IPTG thì gen lacZ cũng không tổng hợp enzyme β- galactosidase và không xảy ra sự chuyển hóa X-gal. Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen barcode chèn vào có thể là chứa đoạn gen là sản phẩm phụ của phản ứng PCR, sự đột biến trên promoter lac hay sự đứt gãy base thymine đầu 3’ của vector cũng có thể làm cho khuẩn lạc mang màu trắng. Vì vậy để có thể biết chính xác các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp cần tiến hành chọn bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony - PCR) để phục vụ cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.
Từ kết quả trên cho thấy quá trình biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến có kết quả tốt. Trên đĩa nuôi cấy xuất hiện những khuẩn lạc xanh và trắng. Trong đó mật độ là số lượng khuẩn lạc trắng tương đối lớn, đủ để tiến hành chọn lọc khuẩn lạc.
3.2.4. Kết quả chọn dòng tế bào mang gen tái tổ hợp
Để xác định chính xác khuẩn lạc nào mang vector gắn đoạn DNA quan tâm chúng tôi tiến hành phản ứng colony-PCR. Với phương pháp này giúp chúng ta phát hiện nhanh những dòng khuẩn lạc nào mang gen đích, giảm chi phí và tiết kiệm thời gian. Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc trắng trên đĩa khuẩn lạc, sau đó thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu với gen ITS và rpoC1 như đã trình bày ở Bảng 2.7. Phương pháp tiến hành cụ thể được trình bày ở mục 2.2.2.6. Sản phẩm colony-PCR được điện di trên gel
bp 750 500 250 B bp 550 A 750 500 250 650
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR - clony các khuẩn lạc sử dụng mồi rpoC1(A) và mồi ITS (B)
M : thang Marker 1Kb; 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc chọn lọc
Khi sử dùng mồi RpoC1 kết quả điện di trên hình 3.6 xuất hiện các
băng vạch duy nhất có kích thước vào khoảng hơn 550 bp. Còn khi sử dụng mồi ITS nhân lên đoạn gen có kích thước khoảng 650 bp, kết quả điện di Hình 3.6 cho thấy đa phần các khuẩn lạc đều xuất hiện các băng vạch duy nhất có kích thước khoảng 650bp. Như vậy cho thấy các dòng khuẩn lạc đều mang gen quan tâm, những khuẩn lạc này sẽ được nuôi và tách plasmid phục vụ cho việc xác định trình tự DNA.
3.2.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp
Các dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen ở trên được lựa chọn và được nuôi trong 3 ml môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/l, lắc 200 vòng/phút qua đêm, sau đó tiến hành tách plasmid. Quá trình này được thực hiện theo quy trình đã được trình bày ở mục 2.2.2.8. Plasmid được điện di
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết plasmid
1,2,3,4 các plasmid mang gen ITS; 5,6,7,8 các plasmid mang gen rpoC1
Qua kết quả điện di plasmid hình 3.7 ta thấy các plasmid tái tổ hợp đều có 3 băng rõ nét không bị đứt gẫy. Plasmid sẽ được tinh sạch sử dụng để xác định trình tự trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer.
3.3. Kết quả xác định trình tự đoạn các đoạn gen nghiên cứu.
Các đoạn DNA sau khi được tách dòng thành công sẽ được xác định trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer.
Trình tự DNA được so sánh và liên kết với nhau bằng chương trình BioEdit và tiếp tục được xác minh, so sánh với các trình tự khác bằng cách sử dụng công cụ BLAST trên trang wev của Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Kết quả đọc trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit và DNASTAR và đối chiếu với những trình tự đã được công bố trên GenBank. Chúng tôi tiến hành phân tích kết quả với các mẫu nghiên cứu.
3.3.1. Phân tích trình tự đoạn gen rpoC1
rpoC1 mã hóa cho enzyme RNA polymerase β- tiểu đơn vị của lục lạp. Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm. Trong nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng rpoC1 là một chỉ thị rất hữu ích khi được sử
dụng để phân biệt các loài thực vật.
Kết quả so sánh trình tự nuleotide bằng phần mềm BioEdit ở hình 3.8 cho thấy, gen rpoC1 phân lập từ mẫu cây Sói rừng thu thập tại Lạng Sơn có
kích thước khoảng 550 bp, đúng so với kích thước lý tính toán thuyết.
Từ kết quả xác định trình tự, chúng tôi tiến hành so sánh mức độ tương đồng của gen rpoC1 ở mẫu sói rừng nghiên cứu với những kết quả đã công bố trên ngân hàng gen thế giới - NCBI. Kết quả xác định và so sánh trình tự được trình bày ở hình 3.8.
Phân tích bằng BLAST trong NCBI cho kết quả trình tự gen rpoC1
phân lập từ mẫu cây Sói rừng thu thập tại Lạng sơn có độ tương đồng với trình tự gen rpoC1 mang mã số EF380352và KP256024. Kết quả đã khẳng định
đoạn gen phân lập từ mẫu sói rừng thu thập được chính là gen rpoC1. Như
vậy chúng tôi đã nhân bản thành công và giải trình tự đoạn gen rpoC1 phân
lập từ mẫu Sói rừng từ Lạng Sơn.
Kết quả so sánh trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ mẫu Sói (SR)
rừng thu tại Lạng sơn cho thấy, mẫu SR và EF380352 trên Ngân hàng gen (phân lập từ cây sói Chloranthus spicatus tại Trung Quốc) có độ tương đồng là 98,4%; còn tương đồng với trình tự có mã số KP256024 trên ngân hàng gen (phân lập từ cây sói nhật Chloranthus japonicus tại Mỹ) có độ là 97,6%.
Hình 3.8. Trình tự nucleotide của đoạn rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng và
hai trình tự mang mã số EF380352 và KP256024 trên ngân hàng gen
Phân tích vị trí sai khác cho thấy, trình tự nucleotide của gen rpoC1
phân lập từ mẫu Sói rừng có sự sai khác so với trình tự mang mã số EF380352 ở 10 vị trí và sai khác so với trình tự mang mã số KP256024 ở 14 vị trí. Các vị trí sai khác của trình tự nucleotide mẫu sói rừng so với 2 mẫu EF380352 và KP256024 trên Genbank được thể hiện ở bảng 3.1 Sự sai khác về trình tự nucleotide giữa mẫu sói rừng và các mẫu trên Genbank là thông tin quan trọng để xây dựng mã vach DNA có các mẫu sói rừng khác nhau.
Bảng 3.1. Các vị trí sai khác giữa trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 Vị trí các
điểm sai khác
Trình tự nucleotide của gen rpoC1 của loài có mã số
EF380352 KP256024 SR.rpoC1 5 A A C 15 A G 16 A A G 34 - T C 67 C C T 122 - T C 160 - C T 189 A A G 202 - C T 271 A A C 303 - T G 382 A A G 499 A A G 543 - - G 551 G G A
Bảng 3.2. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của gen
Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của mẫu sói rừng trên cơ sở phân tích gen rpoC1 ở hình 3.9 cho thấy, mẫu SR thu thập từ Lạng sơn –