Sử dụng phương pháp quan sát mô tả trực tiếp đối tượng lựa chọn đại diện kết hợp với phương pháp đối chiếu, so sánh với các tài liệu đã có. Đây là phương pháp thông dụng được dùng trong nghiên cứu thực vật học.
Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật về: - Dạng sống
- Thân
- Lá (hình dạng phiến, chọp, gân, gốc, cuống, kích thước,…) - Hoa (dạng cụm hoa, vị trí cụm hoa, kích thước,…)
- Quả và hạt (hình dạng, màu sắc, kích thước,…)
+ Dụng cụ và thiết bị hỗ trợ: máy ảnh, thước dây, thước kẹp (palme),.. 2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Bảng 2.2. Thành phần dung dịch đệm rửa
STT Hóa chất Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng
1 Sorbitol 350 mM
2 Tris-HCl (pH 8,0) 1 M 100 mM
3 EDTA (pH 8,0) 0,5 M 5 mM
4 Sordium metabisulfit 5%
Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm tách
STT Hóa chất Nồng độ chuẩn Nồng độ cuối cùng
1 NaCl 3 M 1.5 M
2 Tris-HCl (pH 8,0) 1 M 100 mM
3 EDTA (pH 8,0) 0,5 M 20 mM
DNA được tách chiết bằng phương pháp CTAB có cải tiến bao gồm các bước sau.
1. Ngiền nhanh 0,2g lá bằng cối chày sứ trong nitơ lỏng cho đến khi tạo thành bột thật mịn, sau đó chuyển ngay vào ống Eppendorf 2ml, giữ trong đá.
2. Bổ sung 1ml đệm rửa, lắc mạnh trong 40 giây, ly tâm 12000 vòng/phút, 4oC, 7 phút
3. Loại bỏ dịch nổi và lặp lại từ 2 - 3 lần
4. Bổ sung 800 µl đệm chiết, lắc đều và giữ ở 65oC trong thời gian 30 phút đến 1giờ
5. Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút
6. Bổ sung 800 µl chloroform : isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều trong thời gian 10 phút
7. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/ phút trong thời gian 15 phút ở 4oC 8. Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf 1,5 ml
9. Bổ sung một thể tích tương đương isopropanol lạnh và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 30 phút.
10. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong thời gian 15 phút ở 4oC
11.Loại bỏ dich nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 µl cồn 80%, ly tâm 12000 vòng/ phút trong thời gian 4 phút ở 4oC ( Bước này thực hiện 2 lần), sau đó đảo nhẹ nhàng lọa bỏ cồn.
12.Làm khô DNA bằng quạt gió 13.Hòa tan trong 100 µl H2O
14.Sau khi DNA được hòa tan hoàn toàn thì bổ sung 3 µl Rnase (10mg/ml). Giữ sản phẩm ở 37oC trong 1 giờ
15.Bảo quản DNA tổng số ở -20oC
2.2.2.2. Kiểm tra sản phẩm DNA sau khi tách chiết
DNA tổng số của các mẫu thực vật sau khi tách chiết sẽ được điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, ở hiệu điện thế 90V với marker 1kb.
Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số được kiểm tra qua
phương pháp đo mật độ quang phổ hấp phụ ở bước sóng 260 và 280 nm. Mỗi mẫu đo 3
lần và giá trị trung bình của ba lần đo được lấy làm kết quả cuối cùng. Độ tinh sạch của mẫu thể hiện qua thông số A260/280, thông thường A260/280 =1,5 - 2,0 được coi là mẫu sạch protein, nồng độ DNA của mẫu được tính thông qua giá trị 1,0A 260 = 50 µg/µl.
2.2.2.3. Phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR
Thể tích mỗi phản ứng PCR của mỗi mẫu là 25µl, được thực hiện trên máy PCR. Quy trình nhiệt để nhân bản các đoạn gen và thể tích cụ thể của các thành phần trong một phản ứng PCR được thể hiện ở Bảng 2.4, Bảng 2.5 và Bảng 2.6.
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR
TT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl)
1 Nước khử ion vô trùng 12,75
2 Buffer 10X 2,5
3 Magie clorua 25mM 2,0
4 dNTPs 10mM 2,5
5 Mồi xuôi 10pmol 1,0
6 Mồi ngược 10pmol 1,0
7 Taq DNA polymerase 1u/µl 0,25
8 DNA khuôn 3
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt cho
phản ứng PCR nhân ITS Bảng 2.6. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen rpoC1 Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ Khởi động 94 4p 1 Khởi động 94 60s 1 Biến tính 94 40s 35 Biến tính 94 30s 35 Gắn mồi 55 1p Gắn mồi 52 40s
Kéo dài 72 1p Kéo dài 72 50s
Ổn định 72 7p 1 Ổn định 72 10p 1
Bảo
quản 4 Bảo quản 4
Hai cặp mồi được sử dụng để nhân bản 2 gen đích là ITS [21] và
rpoC1 [14]. Trong đó vùng ITS của gen nhân và gen rpoC1 là gen lục lạp. Hai
cặp mồi này được chúng tôi tham khảo trong các nghiên cứu đã được thực hiện trước đó. Trình tự về hai cặp mồi được thể hiện ở Bảng 2.7.
Bảng 2.7. Trình tự mồi dùng trong phản ứng PCR ST T Vùng gen nhân bản Ký hiệu Trình tự mồi (5’- 3’) Kích thước dự kiến 1 ITS (ITS+ITS2) P12F ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG 655 bp P12R TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC P7R CCCAATACCATCATACTTAC 2 rpoC1 1F GTGGATACACTTCTTGATAATGG 550 bp 1R TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC
Phương pháp chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Chuẩn bị khuôn đổ gel đã cài sẵn răng lược. Hòa tan 1g agarose trong 100ml TAE 1X trong bình thủy tinh chịu nhiệt, đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội khoảng 60oC và đổ vào buồng điện đi. Chiều dày gel khoảng 5mm là thích hợp. Sau 30-40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra và đặt bản gel trong bể điện di, đổ đệm TAE 1X vào bể điện di cho đến khi mức đệm cao hơn mặt gel từ 1-2mm
Trộn 7µl DNA với 4µl dye, tra vào một giếng nhỏ trên gel. Điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 110V trong khoảng 30 phút.
Lấy bản gel ra khỏi máy điện di và cho vào khay chứa dung dịch ethidium bromide 1% trong 10 phút. Lấy bản gel ra, rửa sạch bằng cách ngâm trong nước cất 2-3 phút. Đem vào máy quan sát dưới đèn tia tử ngoại (UV) và chụp ảnh.
2.2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch DNA từ gel agarose bằng “AccuPrep PCR purification Kit” của hãng “Bioneer” (Hàn Quốc) theo quy trình của nhà sản xuất. Gồm các bước sau:
1. Điện di sản phẩm khuếch đại, cắt băng gel cho vào ống Eppendorf 1,5 ml
2. Bổ sung đệm hòa tan (GB-Gel binding buffer) theo tỷ lệ Vmẫu:VGB = 1:5 3. Ủ ở nhiệt độ 60oC trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lắc nhẹ một lần, sau
khi gel tan hết thì ủ thêm 5 phút để gel tan hoàn toàn.
4. Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch chảy qua cột.
5. Bổ sung 500 µl đệm GB vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Bước này nhằm loại bỏ hoàn toàn những thành phần gel agarose còn sót lại.
6. Rửa màng lọc chứa DNA bằng cách thêm 500µl đệm rửa WB (Washing buffer) lên cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm lần 2 để đảm bảo loại bỏ hết dịch WB.
7. Chuyển cột lọc sang ống Eppendorf 1,5ml, bổ sung 30µl dung dịch đệm EL (Elution buffer) lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem ly tâm 13000 vòng/ phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, thu dịch chứa mẫu DNA đã tinh sạch chuyển sang ống mới. Bảo quản ở - 20oC
8. Điện di kiểm tra sản phẩm sau khi tinh sạch.
2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector
Sau khi đoạn DNA được tinh sạch, tiến hành gắn chúng vào vector tách dòng thông qua phản ứng lai DNA sử dụng enzyme DNA T4 - ligase. Vector sử dụng là vector pBT (Hình 2.1)
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT
Phản ứng ghép nối ở điều kiện 22oC trong 90 phút. Sản phẩm sau khi ghép nối được sử dụng để biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng
Thành phần phản ứng Thể tích (µl) H2O 3 Buffer T4 ligase 1 pBT 1 T4 DNA ligase 1 DNA 5 Tổ thể tích 10
2.2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt.
1. Tế bào khả biến được lấy ra từ tủ -84oC và để tan từ từ.
2. Bổ sung 5l vectơ đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp được đặt trong đá 10-15 phút.
3. Chuyển mẫu sang bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42oC trong 90 giây. Sau đó mẫu được lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong 5 phút.
4. Bổ sung 500l môi trường LB lỏng, hỗn hợp được nuôi ở 370C, lắc 200 v/p trong 1 giờ.
5.Sử dụng que cấy trải, trải 100 - 200 l dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc có chứa 50mg/l Kanamycin. Ủ đĩa ở 37oC qua đêm.
Bảng 2.9. Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang
DNA tái tổ hợp Hóa chất Thể tích Xgal (0,004%) 40 μl IPTG (100 μM) 20 μl Carbecilin (100 mg/l) 20 μl LB đặc 20 ml
2.2.2.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony - PCR)
Sau khi nuôi khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, từ mỗi đĩa chọn ra một số khuẩn lạc trắng để tiến hành phản ứng colony - PCR với các cặp mồi rpoC1 và ITS. Thành phần phản ứng colony - PCR và chu kì nhiệt
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng colony - PCR STT Thành phần Nồng độ Thể tích (l) 1 Nước khử trùng 13,8 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 25 mM 2,5 4 dNTPs 10 mM 2
5 Mồi xuôi 10 pmol 1
6 Mồi ngược 10 pmol 1
7 Dream Taq polymerase 5U/l 0,2
8 Khuẩn lạc VK
Tổng 25
Bảng 2.11. Chu trình nhiệt của phản ứng colony-PCR
Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
Khởi động 94 5 phút 1
Biến tính 94 30 giây
25
Gắn mồi 58 50 giây
Kéo dài 72 50 giây
Ổn định 72 10 phút 1
Bảo quản 4 ∞
Điện di kiểm tra sản phẩm colony - PCR trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn.
2.2.2.8. Tách chiết plasmid từ tế bào E. coli
Quy trình tách DNA plasmid được tiến hành theo phương pháp sử dụng phenol/chloroform có cải tiến sử dụng hóa chất bao gồm 3 dung dịch Sol I, Sol II và Sol III .
Bảng 2.12. Thành phần hóa chất tách plasmid
Kí hiệu Thành phần
Sol I Glucose (50 mM), Tris-HCL (25 mM), EDTA (10 mM)
Sol II NaOH (0,2 N), SDS (1%)
Sol III 60 ml potassium acetate 5 M, 11,5 ml axit acetic, 28,5 ml H2O
Các bước tiến hành:
- Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào Eppendorf 2ml, ly tâm 7000 vòng/phút (v/p) trong 5 phút. Thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.
- Thêm 100 µl dung dịch Sol, hoà tan bằng vortex cho cặn tan hoàn toàn. - Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II đảo nhẹ.
- Thêm 150 µl dung dịch Sol III đảo nhẹ rồi đặt trong đá 5 phút. - Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút. Thu dịch nổi.
- Bổ sung dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1:1. - Ly tâm 13000v/p trong 10 phút. Chuyển pha trên sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.
- Bổ sung dung dịch isopropanol lạnh theo tỷ lệ 1:1, ủ ít nhất 20 phút. - Ly tâm 13000 v/p trong 20 phút, thu tủa.
- Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm 50 µl nước khử ion, để ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn.
Plasmid sau khi tách chiết được tinh sạch và bảo quản ở -200C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2.9. Phương pháp xác định trình tự của gen
Trình tự DNA được xác định bằng máy phân tích trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer theo nguyên lí của Sanger với bộ kit BigDye Terminator v. 3.2 Cycle Sequencing (Macrogen Inc. Hàn Quốc). Trình tự DNA đã giải được xử lý và phân tích bằng phần mềm BioEdit và DNAstar. Cây phân loại được xây dựng theo phương pháp tối đa (Maximum Parasimony (MP) trên cơ sở số liệu thu được.
2.2.2.10. Phương pháp phân tích số liệu
Sau khi cây sói rừng đem về sẽ tiến hành đo kích thước như chiều cao cây, kích thước trung bình của rễ, cuống lá, phiến lá, hoa, quả ,….
Trình tự nucleotide sau khi giải trình tự sẽ được xử lý bằng các phần mềm bioedit, BLAST, DNAstar. Lập bảng biểu, nhập các số liệu sau đó đưa ra nhận xét, phân tích và rút ra kết luận.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm thực vật học của cây sói rừng thu tại Lạng Sơn
Sói rừng là cây bụi thường xanh, cao 1 - 2m, có bộ rễ phát triển, dễ chính dài khoảng 25- 30 cm, đường kính khoảng 0,5 - 1cm, có nhiều rễ con phát triển, có mầu nâu vàng, rễ cứng.
Cây Sói rừng có thân gỗ, nhánh tròn, không có lông, thân có màu xanh đậm, các mấu hơi phồng ra, phần thân non có mầu xanh, phần thân già có màu hơi đỏ tía. Mặt cắt ngang có hình tròn, đường kính thân khoảng 0,5 - 1,5 cm. Lá đơn mọc đối, phiến lá có hình elip, hình trứng
Hình 3.1. Mẫu cây sói rừng thu thập tại
Lạng sơn
ngược hoặc elip hẹp đến thuôn, chóp lá nhọn, dài 7 - 20cm, rộng 3 - 5cm, gốc thon nhọn, mép lá có răng cưa nhọn và thô, phần không xẻ gần cuống dài 3 - 3,2cm, gân lông chim, gân chính nổi rõ với 5 - 7 cặp gân nhọn, gân bên hình cung mờ, gân lồi mặt dưới, cuống ngắn 5 - 10mm. Lá nhẵn, không có lông, mặt trên có mầu xanh sẫm, mặt dưới nhạt. Bông kép, ít nhánh, nhánh ngắn. Cụm hoa có mầu xanh nhạt hoặc trắng, dài 3 - 8cm, bông khá dày, dài 1 - 3,5cm. Hoa cái nhỏ, màu trắng, dạng phích hoặc dạng cầu méo, dài 1 - 1,5mm, không cuống và có một nhị.
Hình 3.2. Các bộ phận của cây sói rừng
1 - Rễ; 2 - thân ; 3 - Lá; 4 - Cách sắp xếp lá; 5 - Hoa; 6 - cành mang quả; 7- Quả
Marker DNA tổng số
DNA tổng số
Theo một số nghiên cứu về đặc điểm hình thái của cây sói rừng đã được tiến hành nghiên cứu trước đó, Sói rừng có bầu nhụy hình trứng và không có vòi, hóa đực dài 1,3 - 2mm, rộng 1 - 1,3 mm, bao phấn kéo dài từ một nửa đến toàn bộ chiều dài. Cây sói rừng có quả nhỏ, mọng, hình gần tròn đường kính 4 - 7 mm. Quả ban đầu xanh, khi chín có màu đỏ hay đỏ gạch, hạt không mở màu vàng hoặc kem [10]. Cây thường mọc ở vùng núi đất, ở bìa rừng, ven đồi ẩm, sườn núi, các khu đầm lầy, đồng cỏ, ven suối. Cây có hoa vào tháng 6 - 7, quả tháng 8 - 9.
Phân bố: Ở Việt Nam cây mọc từ Hà Giang (Vị Xuyên), Sơn La (Mộc Châu), Cao Bằng (Thạch An, Nguyên Bình, Tĩnh Túc), Lạng Sơn (Hữu Lũng, Bắc Sơn), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội (Hà Tây), Thừa Thiên Huế, Kom Tum ( Đác lây, KonPlong), Lâm Đồng (Đà Lạt, Bảo Lộc). Trên Thế giới, cây có ở Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên, Malaysia, Indonesia, Lào, Thái Lan, Hàn Quốc.
3.2. Phân lập gen từ mẫu cây sói rừng
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số
Để tách được DNA từ mẫu lá của cây sói rừng có chất lượng tốt và đáp ứng các mục đích thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp dùng CTAB (Collins và Symons, 1992) [17] với một số thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm (mục 2.2.2.1). Kết quả điện di (Hình 3.3) cho thấy DNA thu được có đủ số lượng và chất lượng cần thiết, các vạch điện di rõ gọn không bị đứt gãy, ít thấy các vết protein và tạp chất còn dư trong mẫu, đảm bảo chất lượng cho phản ứng nhân gen tiếp theo.
Trong tách chiết DNA tổng số từ thực vật,
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số cây Sói rừng trên gel agarose 1%
có nhiều phương pháp khác nhau đã được ứng dụng, trong đó phương pháp dùng CTAB có ưu điểm là khá đơn giản, tiết kiệm thời gian mà DNA thu được vẫn đảm bảo chất lượng. Đã có nhiều cải tiến trong quy trình tách chiết DNA sử dụng CTAB tỏ ra đặc biệt hiệu quả trong đó với cả các mẫu mô thực vật chứa nhiều polysaccharid và polyphenol (Porebski và cộng sự, 1997) [28]. Hiện nay, phương pháp dùng CTAB để tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô thực vật được sử dụng phổ biến trong các công trình nghiên cứu.