Chuẩn bị:
- Môi trường phát triển tế bào MEM với 5%FCS
- Dung dịch A: Dung dịch cố định tế bào, gồm PBS có 10% Formalin và 1% NP40.
- Dung dịch B: Dung dịch nước rửa, gồm PBS với 1% Tween 80.
- Dung dịch C: Dung dịch pha loãng mẫu, gồm PBS với 1% Tween 80 và 5% sữa gầy. - Dung dịch E: Dung dịch AEC, gồm 1ml dung dịch AEC nguyên chất và 14ml dung
dịch đệm axetat 0,1M (pH 5,2) sau đó thêm 15µl H2O2 30%. - Tế bào Marc 145 một lớp.
- Giống virus chuẩn PRRS VN07196.
Các bước tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị tế bào Marc 145 một lớp trên đĩa 96 giếng với nồng độ 5x104 tế bào/ml.
Bước 2: Nhiễm virus PRRS chuẩn với liều 500TCID50/ml, 100µl/ giếng. Ủ đĩa từ 1-2 ngày trong tủ ấm 37 oC, 5% CO2.
Bước 3: Cố định tế bào đã nhiễm virus + Bỏ môi trường duy trì tế bào trong đĩa + Cho 100µl dung dịch A vào mỗi giếng + Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
+ Đổ bỏ dung dịch A, rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch B Bước 4: Gắn mẫu cần kiểm tra
+ Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2, huyết thanh đối chứng dương.
+ Chuyển 50µl huyết thanh đã pha loãng ở các nồng độ khác nhau vào các giếng. + Ủ đĩa ở 37oC trong 30 phút.
+ Đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rồi rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch B. Bước 5: Gắn kháng kháng thể PRRS có gắn enzyme (conjugate + peroxidase) (kháng thể này được chế trên thỏ)
+ Pha loãng conjugate trong dung dịch B theo tỷ lệ 1/600. + Nhỏ 50µl conjugate đã pha loãng vào các giếng.
+ Ủ đĩa 37 oC trong 30 phút
+ Đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rồi rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch B. Bước 6: Cho cơ chất
+ Ủ đĩa ở nhiệt độ 25oC trong 30 phút. - Bước 7: Đọc kết quả dưới kính hiển vi soi ngược
+ Nếu quan sát thấy thảm tế bào trong giếng có những đám tế bào bắt màu đỏ đậm thì mẫu huyết thanh cho vào giếng đó dương tính với kháng thể PRRS.
+ Nếu quan sát thấy toàn bộ thảm tế bào trong giếng có màu hồng nhạt là màu của môi trường MEM thì mẫu huyết thanh cho vào giếng đó âm tính với kháng thể PRRS (TCVN 8400-21:2014).