chọn làm chủng ứng viên để tạo virus giống gốc PRRS nhược độc
Nghiên cứu tạo được chủng virus PRRS nhược độc sử dụng làm giống gốc chế tạo vaccine PRRS đạt hiệu quả bảo hộ thì việc chọn chủng virus độc lực cao là nội dung công việc đầu tiên cần tiến hành nghiên cứu để đáp ứng các yêu cầu:
- Virus PRRS độc lực có nguồn gốc được phân lập từ lợn mắc PRRS ổ dịch Việt Nam, khi thử độc lực của virus trên lợn gây triệu trứng lâm sàng rõ rệt, thể hiện qua bệnh tích đại thể, vi thể điển hình, đặc trưng của lợn nhiễm PRRS, có hiện tượng virus huyết kéo dài, khả năng kích thích miễn dịch sinh kháng thể ở lợn kháng PRRS cao.
- Virus PRRS thích ứng và phát triển ổn định trên môi trường tế bào dòng Marc 145 khi phân lập và nuôi cấy, đạt hiệu giá virus cao.
lợn mắc PRRS ổ dịch tại Thái Bình và Hưng Yên Việt Nam đã được nghiên cứu đánh giá độc lực và các đặc tính sinh học bằng cách gây nhiễm 02 chủng trên lợn, theo dõi các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp: ốm, sốt cao, bỏ ăn, gần như không tăng cân trong 14 ngày đầu sau gây nhiễm (Bảng 3.1). Bệnh tích tổn thương đại thể, vi thể biểu hiện rõ ở một số cơ quan như: bệnh tích phổ biến, tim, gan, lách, thận, hạch màng treo ruột bệnh tích nặng (Bảng 3.3; Hình 3.1; 3.2). So sánh các tổn thương, bệnh tích cũng tương tự kết quả nghiên cứu của (Lê Văn Năm, 2007; Tiêu Quang An và cs 2011; Done et al., 1996; Feng et al., 2007; Trịnh Đình Thâu và cs, 2017). Đây là các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể và vi thể điển hình thể hiện độc lực của các chủng virus PRRS trên lợn.
Tuy nhiên, một tiêu chí quan trọng nữa được sử dụng trong các đánh giá về độc lực virus và hiệu lực vaccine trong nghiên cứu là tình trạng virus huyết. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiện tượng virus trong máu lợn xuất hiện kéo dài đến 21 ngày và chiếm tỉ lệ 100% số lợn thí nghiệm khi gây nhiễm lợn bằng chủng virus PRRS 02HY, tỉ lệ lợn có virus huyết kéo dài đến 21 ngày cao gấp 3 lần chủng virus PRRS 05TB, virus trong máu lợn xuất hiện đến 21 ngày chiếm tỉ lệ 33,3% số lợn thí nghiệm (Bảng 3.4). Như vậy, có thể nói, nếu dựa trên tiêu chí virus huyết thì chủng 02HY là chủng có ưu thế hơn trong việc tuyển chọn làm chủng khởi đầu cho việc nghiên cứu tạo chủng vaccine PRRS nhược độc.
Ngoài ra, tính sinh miễn dịch bảo hộ là một trong những đặc tính quan trọng nhất của chủng virus vaccine. Nghiên cứu thực nghiệm kiểm tra khả năng kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể chống lại virus PRRS bằng phản ứng IPMA đã xác định được chủng virus 02HY có khả năng gây miễn dịch tạo kháng thể kháng virus PRRS trên lợn cao hơn nhiều so với chủng 05TB, hiệu giá kháng thể trung bình chủng 02HY là 1/3.620,386, chủng 05TB là 1/735,17 với liều gây nhiễm như nhau 1ml 104TCID50/lợn (Bảng 3.5). Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng virus 02HY có tính kháng nguyên cao nên khả năng kích thích sinh miễn dịch ở lợn cao hơn nhiều so với chủng virus 05TB. Đây là tiêu chí rất quan trọng để lựa chọn chủng virus PRRS làm chủng độc lực để tạo giống gốc.
tạo ra được vaccine có tính an toàn và hiệu lực cao thì tiêu chí về năng suất của chủng virus vaccine được tạo ra trong một môi trường nuôi cấy tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với giá thành vaccine. Do đó, tiêu chí lựa chọn khả năng thích nghi và nhân lên của virus trên tế bào Marc 145 cũng rất quan trọng, đánh giá thông qua độ biến động về trị số TCID50, cũng từ đó xác định được thời điểm thu virus thích hợp nhất là thời điểm virus có hiệu giá virus cao nhất. Kết quả (Bảng 3.6; Hình 3.3) nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng virus PRRS 02HY cường độc sau gây nhiễm 24 giờ virus bắt đầu quá trình sinh trưởng, hàm lượng virus phát triển tăng dần theo thời gian nhiễm và đạt cao nhất từ 80-96 giờ sau nhiễm là 106.43TCID50/ml đến 106.63TCID50/ml. Đây là thời điểm thu hoạch virus tốt nhất và hiệu giá virus ổn định nhất. Kết quả này tương đương với kết quả nghiên cứu của (Feng et al., 2007; Nguyễn Bá Hiên và cs 2013; Lê Thị Toan và cs 2016; Phạm Văn Sơn và cs 2017).
Từ những kết quả nghiên cứu nêu trên có thể thấy chủng virus PRRS 02HY cường độc có đầy đủ các đặc tính nổi trội đáp ứng các yêu cầu nghiên cứu tiếp theo để phát triển thành chủng virus vaccine PRRS, gồm:
1) Là chủng virus lưu hành tại Việt Nam, gây bệnh thực nghiệm trên lợn đặc trưng với triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể, vi thể điển hình, virus huyết kéo dài;
2) Tính kháng nguyên cao, kích thích miễn dịch sinh kháng thể cao trên lợn; 3) Phát triển ổn định thích ứng trên môi trường tế bào dòng Marc 145.
Như vậy, có thể kết luận: Chủng virus 02HY cường độc đảm bảo các tiêu chí làm ứng viên để tạo giống gốc nhược độc cho chế tạo vaccine PRRS.
4.2. Về nghiên cứu tạo chủng virus PRRS nhược độc bằng cấy truyền liên tiếp trên môi trường tế bào Marc 145
Một số loại vaccine nhược độc đã được sản xuất thành công trên thế giới và cho thấy hiệu quả cao trong phòng chống dịch bệnh PRRS xảy ra ngoài thực địa. Về nguyên lý chung, để tạo chủng virus PRRS nhược độc làm giống gốc sản xuất vaccine, chủng virus PRRS cường độc được cấy truyền (passage) nhiều đời liên tiếp trên môi trường tế bào Marc 145 để tạo thành chủng virus PRRS nhược độc, hãng Boehringer Ingelheim Corp đã cấy truyền 37 đời (Allende et al., 2000),
hãng Hippra Corp đã cấy truyền 20 đời (Burch et al., 1999), Han et al., 2009 đã cấy truyền 80 đời, Tian et al., 2007 đã cấy truyền 112 đời, Leng et al., 2012 đã cấy truyền 92 đời, Yu et al,. 2015 cấy truyền 82 đời, Trịnh Đình Thâu và cs, 2018 cấy truyền 90 đời. Sau đó giống sẽ được kiểm tra đặc tính nhân lên, đặc tính sinh miễn dịch, đặc điểm gen, độc lực của virus trên tế bào dòng Marc 145 và trên bản động vật để khẳng định giống nhược độc hoàn toàn và an toàn trên lợn.
Áp dụng nguyên lý trên, chủng virus PRRS 02HY cường độc được tiến hành cấy truyền liên tiếp trên tế bào Marc 145, cách 10 đời cấy truyền tiến hành chuẩn độ hiệu giá virus một lần. Từ đời cấy truyền thứ 50 trở đi, cách 10 đời cấy truyền tiến hành kiểm tra tính sinh miễn dịch của chủng 02HY trên lợn thông qua đánh giá hàm lượng kháng thể có trong máu lợn được gây nhiễm, đồng thời kiểm tra độc lực của virus trên lợn. Sau quá trình cấy truyền trên tế bào, chủng virus PRRS 02HY thích nghi trên môi trường tế bào Marc 145 thể hiện qua sự tăng hiệu giá virus, từ hiệu giá ban đầu đạt 104.9TCID50/ml sau 80 đời hiệu giá virus trung bình đạt 106,7TCID50/ml. Từ khoảng đời 50, chỉ số nhân lên của virus dường như tăng rất chậm hoặc không tăng, đạt giá trị cao nhất và ổn định (Bảng 3.7; Hình 3.4). Các virus tiếp đời 80 được nhân lên và bảo quản ở -80oC để giám định các đặc tính giống virus vaccine nhược độc, kết quả phù hợp với (Han et al., 2009) đã cấy truyền virus PRRS 80 đời.
Tính sinh miễn dịch của chủng virus dùng trong sản xuất vaccine là một trong hai tính chất quan trọng nhất của chủng dự truyển vaccine. Do đó, tính chất này của chủng PRRS 02HY đã được kiểm tra liên tục qua các đời cấy truyền khác nhau. Kết quả cho thấy, chủng virus PRRS 02HY tuy có thay đổi về một số tính chất như khả năng nhân lên trên môi trường tế bào Marc 145, độc lực giảm dần nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên ổn định, kích thích tạo đáp ứng miễn dịch tốt trên các lợn từ 1/2.560 đến 1/3.620,386, từ đời P70, P80 hiệu giá kháng thể ổn định, đạt cao nhất 1/3.620,386 (Bảng 3.8).
Một đặc tính quan trọng nữa của chủng virus nhược độc dự tuyển sử dụng chế tạo vaccine là độc lực của chủng virus đó. Virus nhược độc tạo được phải có độc lực thấp, không gây bệnh cho lợn và có tính ổn định cao. Việc kiểm tra độc lực
của chủng giống được tiến hành trên các đời cấy truyền virus: P1, P50, P60, P70, P80, trong khi các lợn được tiêm virus ở các đời cấy truyền P50 và P60 liều tiêm 106,0TCID50 cao hơn đời P1 nhưng lợn chỉ có biểu hiện sốt nhẹ (cao hơn thân nhiệt bình thường 0,5oC), không có biểu hiện bệnh lý của lợn mắc PRRS. Với những lợn tiêm virus ở đời cấy truyền P70 và P80 không quan sát được hiện tượng lợn sốt. Điều này chứng tỏ độc lực của virus đời P1 rất cao, sau khi cấy truyền liên tiếp virus trên môi trường tế bào Marc 145 đến đời cấy truyền P50 và P60 virus đã giảm độc lực nhiều chỉ còn gây sốt nhẹ cho lợn, và đến đời cấy truyền P70 và P80 virus đã giảm độc lực hoàn toàn gần như không có hiện tượng lợn sốt và không gây các biểu hiện bệnh lý (Bảng 3.9), hiệu quả làm giảm độc lực tương đương với nghiên cứu của Trịnh Đình Thâu và cs 2018 khi cấy truyền virus KTY-PRRS-06 phân lập từ lợn mắc PRRS tại Nam Định sau 90 đời cấy truyền trên tế bào Marc 145.
Một tiêu chí rất quan trọng đối với vaccine nhược độc là khả năng tạo đáp ứng miễn dịch sạch (sterile immunity), có nghĩa là virus phải được loại bỏ hoàn toàn sau khi gây miễn dịch và không bài thải ra môi trường. Chỉ tiêu về virus huyết là yếu tố quan trọng để đánh giá đáp ứng miễn dịch sạch của một vaccine nhược độc. Kết quả khảo sát virus huyết của chủng virus PRRS 02HY cho thấy, ở đời cấy truyền P70 và P80 sau khi gây nhiễm trên lợn đến ngày thứ 6 số lợn có virus huyết đã giảm với tỉ lệ 40% và chỉ kéo dài virus huyết đến ngày 9 với tỉ lệ thấp, ngày thứ 12 không còn virus huyết. Điều này chứng tỏ virus PRRS đời P1 tính cường độc còn nguyên của chủng độc lực, virus huyết kéo dài, sau khi cấy truyền liên tiếp virus trên môi trường tế bào Marc 145 đến đời cấy truyền P50 và P60 virus đã giảm độc lực và đến đời cấy truyền P70 và P80 virus đã giảm độc lực hoàn toàn không còn hiện tượng virus huyết kéo dài (Bảng 3.10; Hình 3.5).
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu kiểm tra các đặc tính sinh học, chủng virus PRRS 02HY nhược độc hóa được tiếp tục nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử về hệ gen, tính thuần khiết, vô trùng an toàn, hiệu lực để ứng dụng chế tạo vaccine PRRS nhược độc TCVN 8685-12:2014 và được đặt tên là Hanvet1.vn.
Về đặc tính sinh học phân tử hệ gen của chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc, kết quả sau khi giải trình tự toàn bộ hệ gen có kích thước 15.276 bp gồm
3.306 A, 4.036 C, 3.995 G và 3.939 T, tỷ lệ A+T chiếm 47,42%, G+C chiếm 52,68%, có 8 khung đọc, mã hóa cho 8 protein, hệ gen được đăng ký trên Genbank với mã số KU842720 (Hình 3.7; Bảng PL3.1). Đây là cơ sở dữ liệu quan trọng để theo dõi sự biến đổi di truyền liên quan tới giá trị bảo hộ của vaccine trong quá trình chế tạo, sử dụng vaccine.
Phân tích các biến đổi di truyền chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc so với chủng virus PRRS 02HY cường độc ban đầu (Bảng 3.11 và Phụ lục Bảng: PL3.2; PL3.3; PL3.4; PL3.5; PL3.6; PL3.7; PL3.8; PL3.9) cho thấy: Chủng Hanvet1.vn nhược độc có 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin nằm rải rác trong 7 gen mã hóa cho 7 protein tương ứng NSP1a, NSP1b, GP2, GP3, GP4, GP5, MP, protein NP do gen ORF6 mã hóa không có sự biến đổi axit amin. Kết quả nghiên cứu này có sự khác biệt so với Leng et al,. 2012 khi nghiên cứu chủng cường độc TJ cấy truyền 92 đời để tạo chủng virus TJM nhược độc làm vaccine đã có sự mất đoạn 120 axit amin. Yu et al,. 2015 khi nghiên cứu chủng cường độc JXA1 cấy truyền 82 đời để tạo virus nhược độc làm vaccine đã có sự biến đổi 47 axit amin. Các biến đổi axit amin trên protein của chủng 02HY nhược độc đều là đột biến điểm từ 1 đến 3 axit amin liên tiếp dạng đột biến thay thế, không có đột biến mất axit amin, trong đó 2 protein không cấu trúc NSP1a và NSP1b do gen ORF1a và ORF1b mã hóa có biến đổi nhiều axit amin nhất lần lượt là 25 và 11 axit amin. Biến đổi này có thể liên quan đến thay đổi độc lực của virus PRRS khi so sánh với Tian et al., 2007 và Feng et al., 2007 trong nghiên cứu trên hệ gen của chủng virus PRRS độc lực cao từ Trung Quốc lây lan sang Việt Nam năm 2006. Nghiên cứu Tian et al., 2007 và Feng et al., 2007 đã ghi nhận thay đổi 30 axit amin trên vùng NSP2 thuộc protein không cấu trúc do ORF1a phiên mã có liên quan đến thay đổi độc lực của virus. Hơn nữa, đột biến thay thế axit amin Leucine (L) trên các protein là đột biến quan trọng có thể liên quan đến thay đổi độc lực của virus (Tian et al., 2007 và Feng et al., 2007). Ngoài ra các đột biến thay thế các axit amin Proline (P), Asparagine (N) và Phenylalanine (F) trên các protein là những đột biến quan trọng vì protein Proline (P), Leucine (L) là 2 trong 10 axit amin sinh protein thường nằm ở cấu trúc trung tâm của vòng xoắn và đột biến thay thế Cystein (C)
bằng Arginine (R) cũng là đột biến quan trọng ảnh hưởng tới liên kết S-S trong cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của protein (Nguyễn Ngọc Hải và cs, 2015).
Protein GP5 do gen ORF5 mã hóa nằm trên bề mặt hạt virus và đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào vật chủ, chứa vùng mang kháng nguyên quan trọng có liên quan đến khả năng trung hòa virus của kháng thể (Dea et al., 2000). Gen ORF5 có sự đột biến thay thế 2 nucleotide và 1 axit amin của protein GP5 giữa chủng virus PRRS Hanvet1.vn so với chủng gốc 02HY cường độc ban đầu. Kết quả có sự khác biệt về vị trí và số lượng nucleotide và axit amin khi so sánh với nghiên cứu của Trịnh Đình Thâu và cs 2018 khi cấy truyền virus KTY-PRRS-06 Nam Định sau 90 đời cấy truyền trên tế bào Marc 145 có sự đột biến thay thế 13 nucleotide và 8 axit amin. Leng et al., 2012 sau cấy truyền 92 đời virus TJ có sự đột biến thay thế 4 axit amin ở protein GP5. Tuy nhiên, biến đổi 1 axit amin ở vị trí không thuộc các epitope của kháng nguyên GP5. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau khi cấy truyền 80 đời, mặc dù các gen của chủng Hanvet1.vn có biến đổi so với chủng độc lực 02HY làm nó trở thành chủng nhược độc nhưng gen mã hóa protein kháng nguyên GP5 kích thích sinh kháng thể trung hòa trên lợn không thay đổi tính kháng nguyên.
Hệ gen virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc được so sánh với 3 chủng đại diện cho Việt Nam (07QN), Trung Quốc (07NM) và chủng virus PRRS type Bắc Mỹ chuẩn quốc tế (VR2332) theo công bố của (Feng Y et al., 2008) để so sánh trình tự axit amin của tất cả 8 khung đọc. Kết quả cho thấy sự tương đồng 100% về trình tự axit amin của protein GP5 chủng Hanvet1.vn nhược độc so với chủng đại diện lưu hành ở Việt Nam 07QN (Bảng 3.12).
Với mục tiêu tạo giống gốc cho sản xuất vaccine PRRS nhược độc nội địa từ virus PRRS thu thập từ lợn bệnh tại ổ dịch bùng phát ở một số tỉnh ở Việt Nam nhằm tạo vaccine có tính tương đồng cao về kháng nguyên so với các chủng độc lực đang lưu hành tại Việt Nam. Tiếp tục so sánh trình tự nucleotide gen ORF5 mã hóa kháng nguyên GP5 (là kháng nguyên vỏ phổ biến và quan trọng nhất có vai trò kích
thích miễn dịch tạo kháng thể trung hòa virus PRRS) với protein kháng nguyên GP5