5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
2.2.1. Nhĩm phƣơng pháp định danh lồi Ơ đầu
Các mẫu Ơ đầu đƣợc định danh bằng phƣơng pháp hình thái so sánh theo Phạm Hồng Hộ (1999) [7], Đỗ Tất Lợi (2005) [11] và trang web của Tropicos [183]. Đồng thời, các mẫu Ơ đầu cũng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phân loại học phân tử dựa trên mã vạch DNA với trình tự nucleotide của vùng ITS và đoạn gen
matK, rpoC1, rpoB2.
P ươn p áp ìn t á so sán
Tại mỗi huyện, thu 5 cây Ơ đầu non và thu củ của 5 cây Ơ đầu khác đem trồng tại vƣờn Thực nghiệm khoa Sinh học, trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên. Đặc điểm hình thái của cây Ơ đầu đƣợc quan sát trực tiếp và mơ tả đặc
điểm rễ, thân lá, hoa, quả, hạt. Nhận diện mẫu cây Ơ đầu theo mơ tả của Phạm Hồng Hộ (1999) [7], Đỗ Tất Lợi (2004) [11] và tra cứu trên trang web của Tropicos [135] tại Bộ mơn Thực vật học, khoa Sinh học, trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên.
P ươn p áp p ân oạ ọ p ân tử
Phƣơng pháp phân loại học phân tử dựa vào một số mã vạch DNA nhƣ vùng
ITS, đoạn gen matK, rpoC1, rpoB2. DNA tổng số đƣợc chiết xuất từ lá non của cây Ơ đầu theo Saghai-Maroof và cs (1984) [101].
Trình tự nucleotide của các cặp mồi matK-F/matK-R, ITS-F/ITS-R, rpoC1- F/rpoC1-R, rpoB2-F/rpoB2-R sử dụng trong PCR đƣợc tổng hợp theo Kress và cs (2005) [164] đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.
Chu trình nhiệt của PCR đối với hai cặp mồi rpoC1-F/rpoC1-R và rpoB2- F/rpoB2-R là 94oC trong 1 phút, lặp lại 35 chu kỳ và ở mỗi chu kỳ, biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 53oC trong 40 giây và tổng hợp ở 72oC trong 40 giây; sau 35 chu kỳ là bƣớc kết thúc ở 72oC trong 5 phút, lƣu giữ ở 4oC [164]. Chu trình nhiệt của PCR đối với cặp mồi ITS-F/ITS-R là 94oC trong 4 phút, lặp lại 35 chu kỳ và ở mỗi chu kỳ, biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 57°C trong 60 giây và tổng hợp ở 72°C trong 60 giây; sau 35 chu kỳ là bƣớc kết thúc ở 72°C trong 10 phút. Chu trình nhiệt của PCR với cặp mồi matK-F/matK-R là 94°C trong 1 phút, lặp lại 35 chu kỳ và ở mỗi chu kỳ, biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 53°C trong 40 giây và tổng hợp ở 72°C trong 40 giây; sau 35 chu kỳ là bƣớc kết thúc ở 72°C trong 5 phút.
Các sản phẩm PCR đƣợc phát hiện bằng điện di gel agarose 1,0% và đƣợc tinh sạch bằng cách sử dụng kít GenJET PCR Purification của hãng Fermentas. Các trình tự nucleotide của vùng ITS và đoạn gen matK, rpoC1, rpoB2 đã đƣợc giải trình tự và phân tích bằng BLAST trong NCBI [164]. Trình tự DNA sau khi đọc đƣợc hiệu chỉnh với sự trợ giúp của phần mềm Bioedit v7.0.5.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phƣơng pháp Maximum Likelihood trong phần mềm MEGA X [84].