5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
2.2.3. Nhĩm phƣơng pháp tách dịng gen và thiết kế vector chuyển gen
2.2.3.1. Phân lập gen và tách dịng phân tử
T ết kế ặp mồ PCR và n ân ản n A F3 5 H
Nghiên cứu thơng tin về gen A F3 5 H và thiết kế cặp mồi để nhân gen A F3 5 H dựa trên trình tự gen F3 5 H của cây A. carmichaelii mang mã sốJN635708.1 trên GenBank [89]. Cặp mồi F3 5 H-NcoI-F/F3 5 H-NotI-R đã đƣợc thiết kế nhân bản đoạn mã hĩa của gen A F3 5 H. Kích thƣớc của đoạn DNA đƣợc nhân bản dự kiến là 1581 bp.
RNA tổng số đƣợc tách bằng kít GeneEluteTM Total RNA Miniprep của hãng Sigma. cDNA đƣợc tổng hợp từ RNA tổng số bằng kít SuperScript™ VILO™ cDNA Synthesis.
Nhân bản gen A F3 5 H đƣợc thực hiện bằng PCR với cặp mồi đã thiết kế F3 5 H-NcoI-F/F3 5 H-NotI-R. Thành phần phản ứng PCR đƣợc trình bày ở bảng2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR STT
1 PCR Master Mix
2 F3
3 F3
4 DNA hoặc cDNA khuơn
5 Nƣớc khử ion
PCR nhân gen A
phút; lặp lại 30 chu kì phút và lƣu giữ ở 4oC.
F3 5 H đƣợc thực hiện theo chu trình nhiệt là 94oC trong 3 (94oC/30 giây, 58oC/30 giây, 72oC/1 phút 30 giây); 72oC/7
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1,0% và đƣợc tinh sạch theo kít GenJET PCR Purification của hãng Fermentas.
Tá ịn và xá địn trìn tự n A F3 5 H
Kỹ thuật tách dịng gen đƣợc thực hiện theo Sambrook và Russell (2001) [69]. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng kít Gen JET PCR Purification, sau đĩ gắn vào vector pBT để tạo plasmid tái tổ hợp. Thành phần và điều kiện phản ứng mơ tả ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen A F3 5 H vào vector tách dịng
STT Thành phần
1 T4 DNA Ligase Buffer
2 T4 DNA Ligase 3 AF35H 4 pBT 5 Nƣớc khử ion Tổng thể tích Đ ều k n p ản n : 20oC tron 3
Hỗn hợp gồm 5 µl vector tái tổ hợp và 50 µl dịch tế bào khả biến đặt trong nƣớc đá 20 phút, sau đĩ chuyển ngay vào bể ổn nhiệt ở 42oC trong thời gian 1 phút 30 giây rồi đƣa ngay vào nƣớc đá trong thời gian 10 phút. Sau khi sốc nhiệt bổ sung 150-300 µl LB lỏng để nuơi phục hồi ở 37oC, lắc 200 rpm trong vịng 1 giờ. Cấy trải 150-250 µl dịch khuẩn lên mơi trƣờng LB đặc cĩ bổ sung ampicillin 50 mg/l, X-gal 30 mg/l và IPTG 100 µM và nuơi ở 37oC trong vịng 16 giờ. Thành phần mơi trƣờng nuơi cấy vi khuẩn thể hiện ở phụ lục 11
Chọn dịng khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp dựa trên kiểu hình khuẩn lạc và bằng colony-PCR với cặp mồi F3 5 H-NcoI-F/F3 5 H-NotI-R.
Tách chiết plasmid bằng kít Plasmid Extraction theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Các plasmid tái tổ hợp mang gen A F3 5 H đƣợc xác định bằng phƣơng pháp giải trình tự DNA tự động, trong đĩ mỗi loại dideoxynucleotide đƣợc đánh dấu bằng 1 chất huỳnh quang (fluouchrome) cĩ màu khác nhau trên máy đọc trình tự tự động
ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer. Trình tự nucleotide của gen đƣợc phân tích, so sánh trên phần mềm BLAST và BioEdit.
2.2.3.2. Thiết kế vector biểu hiện gen
Tạo ấu tr độ p m n n uy n A F3 5 H
Xử lý đồng thời vector tái tổ hợp pBT_A F3 5 H và vector pRTRA7/3 bằng
NcoI/NotI, sau đĩ chọn và tinh sạch đoạn DNA theo chỉ dẫn của kit GenJET PCR Purification để thu nhận đoạn gen A F3 5 H và vector mở vịng pRTA7/3. Trộn gen A F3 5 H với vector pRTRA7/3 bổ sung T4 DNA ligase xúc tác cho quá trình ghép nối tạo đƣợc vector tái tổ hợp pRTRA7/3_A F3 5 H mang cấu trúc C MV35S_A F3 5 H_ my _po yA.
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen pCB301_A F3 5 H
Vector tái tổ hợp pRTRA7/3_A F3 5 H đƣợc nhân dịng trong E. coli DH5α và chọn dịng bằng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu F3 5 H-NcoI-F/F3 5 H-NotI-R.
Xử lý đồng thời vector pRTRA7/3_A F3 5 H và vector pCB301 với HindIII, sau đĩ chọn và tinh sạch các b ng DNA điện di theo kích thƣớc để thu nhận các thành phần cần
C MV35S_A C MV35S_A
sung T4 DNA ligase để xúc tác cho quá trình ghép nối tạo đƣợc vector chuyển gen thực vật pCB301_A F3 5 H. Vector tái tổ hợp đƣợc nhân dịng trong E. coli DH5α. Tiến hành chọn dịng bằng colony - PCR với cặp mồi F3 5 H-NcoI-F/F3 5 H-NotI-R.
2.2.3.3. Tạo Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp
Biến nạp vector pCB301-A F3 5 H vào tế bào khả biến A. tumefaciens CV58 bằng xung điện với thơng số 400Ω, 2,5 kV, 2,5 μF rồi đƣa ngay vào nƣớc đá, sau 5 phút bổ sung 200 µl LB lỏng và đảo nhẹ. Chuyển hỗn dịch đã xung điện sang ống Eppendorf 2 ml, nuơi phục hồi khuẩn sau biến nạp ở 28oC, lắc 200 rpm trong 2 giờ. Cấy trải trên mơi trƣờng LB lỏng cĩ kháng sinh kanamycin 50 mg/l và rifamycin 50 mg/l, ủ ở 28oC trong 48 giờ. Tiến hành chọn dịng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp
pCB301_A F3 5 H bằng colony-PCR và dịng A. tumefaciens dƣơng tính sẽ đƣợc lƣu giữ phục vụ cho chuyển gen vào cây đích.