5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
3.1.2. Đặc điểm trình tự nucleotide của vùng ITS và các đoạn gen matK, rpoC1,
3.1.2. Đặc điểm trình tự nucleotide của vùng ITS và các đoạn gen matK, rpoC1, rpoB2 rpoB2
3.1.2.1. Đặc điểm trình tự vùng ITS
DNA tổng số đƣợc tách chiết từ lá non của 2 mẫu Ơ đầu đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi ITS-F/ITS-R. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% cho thấy ở cả 2 làn chạy chỉ xuất hiện một b ng duy nhất với kích thƣớc khoảng hơn 600 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc dự kiến của vùng ITS (Hình 3.2).
Kết quả giải trình tự nucleotide đã xác định đƣợc vùng ITS cĩ kích thƣớc 630 bp (Phụ lục 1). Vùng ITS đƣợc phân lập từ lồi Ơ đầu (A .carmichaelii) bao gồm một phần của đoạn gen 18S rDNA, đoạn khơng mã hĩa ITS1 và gen 5,8S rDNA, đoạn khơng mã hĩa ITS2 và một phần của đoạn gen 28S rDNA đƣợc mơ tả ở hình 3.3.
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân vùng ITS. M: Marker 1 kb; 1: Mẫu Ơ đầu Hồng Su Phì (HSP); 2: Mẫu Ơ đầu Quản Bạ (QB)
Hình 3.3. Sơ đồ vùng ITS của mẫu Ơ đầu
Bằng phần mềm BLAST trong NCBI cho thấy vùng ITS phân lập từ 2 mẫu nghiên cứu Ơ đầu Hà Giang, Việt Nam (ITS-QB, ITS-HSP) cĩ tỷ lệ tƣơng đồng là 98,41%, 98,25 % (đối với ITS phân lập từ mẫu QB), và 97,94%, 97,78% (đối với ITS
phân lập từ mẫu HSP) với hai trình tự ITS của A. carmichaelii (mã số trên GenBank là AY571352 và MH922985) (Phụ lục 2). Kết quả này đã khẳng định trình tự nucleotide phân lập đƣợc là vùng ITS thuộc lồi A. carmichaelii. Trình tự vùng ITS
của 2 mẫu nghiên cứu (ITS-HSP, ITS-QB) đã đƣợc GenBank chấp nhận và cơng bố với các mã số lần lƣợt là MH410519.1, MH410520.1.
3.1.2.2. Đặc điểm trình tự đoạn gen matK
PCR nhân bản đoạn gen matK với cặp mồi matK-F/matK-R từ DNA tổng số và kết quả kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8 % cho thấy ở cả 2 làn chạy chỉ xuất hiện một b ng duy nhất với kích thƣớc khoảng hơn 800 bp tƣơng ứng với
kích thƣớc dự kiến của đoạn gen matK (Hình 3.4). Kết quả giải trình tự nucleotide đã xác định đƣợc đoạn gen matK cĩ kích thƣớc là 822 bp (Phụ lục 3).
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK. M: Marker 1 kb; 1: matK- QB, 2: matK-HSP
Kết quả phân tích BLAST dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK của các mẫu Ơ đầu đƣợc thể hiện ở Phụ lục 4. Tỷ lệ tƣơng đồng của các chuỗi matK
đƣợc phân lập từ các mẫu Ơ đầu Hà Giang, Việt Nam là 98,30% so với hai trình tự
matK của A. carmichaelii (mã số trên GenBank là KY407560 và KX347251). Do đĩ, những kết quả này đã chứng minh rằng đoạn DNA phân lập từ các mẫu ở Hồng Su Phì và Quản Bạ, Hà Giang, Việt Nam là đoạn gen matK của các lồi A. carmichaelii. Trình tự đoạn gen matK của 2 mẫu nghiên cứu (matK-QB, matK-HSP) đã đƣợc GenBank chấp nhận và cơng bố với các mã số lần lƣợt là LS398143.1 và LS398144.1.
3.1.2.3. Đặc điểm trình tự đoạn gen rpoC1 và rpoB2
Kết quả khuếch đại đoạn gen rpoC1 bằng PCR với cặp mồi rpoC1-F/rpoC1-R
thu đƣợc đoạn DNA cĩ kích thƣớc hơn 0,55 kb (Hình 3.5A). Kích thƣớc của đoạn DNA nhân bản đƣợc đúng nhƣ kích thƣớc dự kiến của đoạn gen rpoC1.
A B
Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen rpoC1 (A) và đoạn gen
rpoB2 (B). M: Marker 1 kb; 1: HSP, 2: QB
Kết quả giải trình tự nucleotide thu đƣợc đoạn gen rpoC1 phân lập từ cây Ơ đầu Hà Giang cĩ kích thƣớc gồm 543 nucleotide (Phụ lục 5), trong đĩ cĩ 150 base loại A, 163 base loại T, 131 base loại G, 99 base loại C. Kết quả phân tích bằng BLAST trong NCBI cho thấy trình tự đoạn gen rpoC1 đƣợc phân lập từ cây Ơ đầu Hà Giang cĩ độ tƣơng đồng cao, 99% so với trình tự gen rpoC1 trong hệ gen lục lạp của cây Ơ đầu mang mã số KX347251, KT820663, KT820666, KT820667, KT820668, KT820669, KT820670 trên GenBank. Nhƣ vậy cĩ thể khẳng định đoạn gen phân lập từ cây Ơ đầu Hà Giang là đoạn gen rpoC1 của Ơ đầu.
Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các lồi Ơ đầu thuộc chi
Aconitum dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1 trên sơ đồ hình cây cho thấy từ các mẫu Ơ đầu đƣợc chia làm hai nhánh chính (Phụ lục 6). Các trình tự mang mã số KT820663, KT820665, KT820666, KT820667, KT820668, KT820669, KT820670, KX347251 và rpoC1-HG thuộc nhánh I và trình tự mang mã số
KT820664 thuộc nhánh II. Nhánh thứ nhất lại chia làm 2 nhánh phụ, trong đĩ trình tự mang mã số KX347251 và rpoC1-HG thuộc nhánh phụ thứ nhất và các trình tự cịn lại thuộc nhánh phụ thứ hai. Khoảng cách di truyền giữa 2 nhánh chính I và II là 0,2%. Trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ cây Ơ đầu Hà Giang (rpoC1-HG) và
trình tự mang mã số KX347251 cùng lồi A. carmichaelii thuộc cùng một nhánh phụ của nhánh I.
Kết quả khuếch đại đoạn gen rpoB2 bằng PCR với cặp mồi rpoB2-F/rpoB2-R
thu đƣợc đoạn DNA cĩ kích thƣớc gần 0,5 kb (Hình 3.5B). Kích thƣớc của đoạn DNA nhân bản đƣợc đúng nhƣ kích thƣớc dự kiến của đoạn gen rpoB2. Kết quả giải trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen rpoB2 phân lập từ cây Ơ đầu Hà Giang cĩ kích thƣớc gồm 471 nucleotide (Phụ lục 7), gồm 142 base loại A, 132 base loại T, 113 base loại G, 84 base loại C. Phân tích bằng BLAST từ NCBI cho kết quả trình tự đoạn gen rpoB2 đƣợc phân lập từ cây Ơ đầu Hà Giang cĩ độ tƣơng đồng 99% so với trình tự gen rpoB2 trong hệ gen lục lạp của cây Ơ đầu mang mã số KX347251 trên GenBank. Kết quả phân tích bằng BLAST đã khẳng định đoạn gen phân lập từ cây Ơ đầu Hà Giang là đoạn gen rpoB2 của Ơ đầu.
Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các lồi Ơ đầu thuộc chi
Aconitum dựa trên kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen rpoB2 (Phụ lục 8). Sơ đồ hình cây cho thấy 9 lồi Ơ đầu thuộc cùng chi Aconitum đƣợc phân thành hai nhánh chính, nhánh thứ nhất gồm 2 mẫu là A. carmichaliiKX347251.1 và mẫu Ơ đầu Hà Giang. Nhánh thứ hai gồm 8 mẫu và chia thành 2 nhánh phụ. Khoảng cách di truyền giữa hai nhánh chính I và II là 0,2%. Trình tự đoạn gen rpoB2 phân lập từ cây Ơ đầu Hà Giang (rpoB2-HG) và trình tự mang mã số KX347251 cùng lồi A. carmichaelii thuộc cùng một nhánh phụ của nhánh I.