5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
3.2.2. Nuơi cấy tạo rễ tơ ở cây Ơ đầu
3.2.2.1. Cảm ứng tạo rễ tơ in vitro ở cây Ơ đầu
Hƣớng tiếp cận t ng sinh khối bằng cơng nghệ nuơi cấy rễ tơ nhằm thu nhận các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học từ cây dƣợc liệu hiện đang đƣợc quan tâm và ứng dụng cĩ hiệu quả. Trong nghiên cứu này, bƣớc đầu khảo sát và xác định điều kiện thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ và nhân nuơi t ng sinh khối rễ tơ từ cây Ơ đầu tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm khai thác cĩ hiệu quả các hợp chất cĩ giá trị dƣợc học từ cây Ơ đầu.
Hình 3.12. Hình ảnh kết quả khảo sát vật liệu cảm ứng tạo rễ tơ Ơ đầu. A: Biểu đồ tỷ lệ tạo rễ tơ của mẫu cấy từ mảnh lá, cuống lá và đoạn rễ đƣợc lây nhiễm bởi chủng R. rhizogenes ATTC 15834 (OD600 = 0,6 và AS 100 μmol/l) trong 15 phút và đồng nuơi cấy trong 3 ngày. Các thanh dọc trên các cột thể hiện sai số tiêu chuẩn (SE); các số trên các cột là tỷ lệ tạo rễ tơ (% mẫu cấy). Các chữ cái khác nhau phía trên các cột chỉ ra sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P <0,05) đƣợc kiểm tra bằng Duncan; n = 30. B: Rễ tơ hình thành từ các mảnh lá; C: Rễ tơ hình thành từ cuống lá; D: Rễ tơ hình thành từ các đoạn rễ.
Sử dụng mảnh lá, cuống lá, các đoạn rễ của cây in vitro làm vật liệu cho cảm ứng tạo rễ tơ. Tiến hành lây nhiễm vật liệu bởi vi khuẩn R. rhizogenes với mật độ khuẩn tƣơng ứng với giá trị OD600 = 0,6; nồng độ AS 100 μmol/l; thời gian lây nhiễm 15 phút, thời gian đồng nuơi cấy 3 ngày, nồng độ kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime 500 mg/l, kết quả khảo sát loại vật liệu thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ đƣợc thể hiện ở hình 3.12.
Hình 3.13. Cảm ứng tạo rễ tơ từ các đoạn rễ in vitro đƣợc lây nhiễm R. rhizogenes
trong thời gian 6 tuần tại giá trị OD600 = 0,6 và AS 100 μmol/l trong 15 phút, đồng nuơi cấy trong 3 ngày. Các thanh dọc trên các cột thể hiện sai số chuẩn; các số trên các cột là tỷ lệ tạo rễ tơ (% mẫu cấy). Các chữ cái khác nhau phía trên các cột chỉ ra sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P <0,05) đƣợc kiểm tra bằng Duncan; n = 30.
Nhƣ vậy, điều kiện thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ ở cây Ơ đầu từ các đoạn rễ
in vitro thơng qua lây nhiễm chủng R. rhizogenes ATTC 15834 là OD600 = 0,6, thời gian nhiễm là 15 phút sau đĩ đƣợc đồng nuơi cấy trong 3 ngày trên MS + sucrose 30 g/l + cefotaxime 500 mg/l đƣợc bổ sung với AS 100 μmol/l.
Hình 3.14. Hình ảnh cảm ứng tạo rễ tơ từ đoạn rễ của cây Ơ đầu in vitro trong mơi trƣờng MS. A: Rễ cây Ơ đầu in vitro A; B: Các đoạn rễ bị nhiễm R. rhizogenes trên mơi trƣờng đồng nuơi cấy; C: Các dịng rễ tơ sau 6 tuần; D: Sinh khối rễ tơ Ơ đầu sau 4 tuần trong mơi trƣờng lỏng chứa cefotaxime 500 mg/l; E: Sinh khối rễ tơ Ơ đầu sau 6 tuần trong mơi trƣờng lỏng.
3.2.2.2. Khảo sát mơi trường nhân nuơi tăng sinh khối rễ tơ Ơ đầu
Tiến hành khảo sát ba trạng thái mơi trƣờng nhân nuơi sinh khối rễ tơ Ơ đầu, đĩ là mơi trƣờng ở trạng thái rắn, bán lỏng và lỏng trong điều kiện lắc sau 6 tuần đƣợc trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Sự sinh trƣởng của rễ tơ Ơ đầu sau 6 tuần trên các loại mơi trƣờng khác nhau Trạng thái mơi trƣờng Khối lƣợng rễ tơ tƣơi ban đầu (g/bình)
Sinh khối rễ tơ Ơ đầu sau 6 tuần Khối lƣợng rễ tơ
tƣơi (g/bình)
Khối lƣợng rễ tơ tăng so với ban đầu (lần) Khối lƣợng rễ tơ khơ (g/bình) Lỏng 0,55 3,22a ± 0,33 5,85 0,339A ± 0,013 Bán lỏng 0,55 2,26b ± 0,02 4,11 0,213B ± 0,006 Rắn 0,55 1,64c ± 0,04 2,98 0,151C ± 0,002
Ghi chú: các chữ cái khác nhau phía trên các cột bi u thị sự khác bi t ý n ĩ thống kê (P <0,05) với kết quả Test bằng Duncan; n = 15.
Bảng 3.5 cho thấy, rễ tơ nuơi trên mơi trƣờng lỏng cĩ sinh khối rễ cao nhất (3,22 g khối lƣợng tƣơi/bình), tiếp theo là mơi trƣờng bán lỏng (2,26 g khối lƣợng
tƣơi/bình) và cuối cùng là mơi trƣờng rắn (1,64 g khối lƣợng tƣơi/bình). So với khối