T ổng quát: HNO2 +2e + 2H+ → NH3+ O
7.7 Quá trình cố định nitơ phân tử
Chỉ sinh vật tiền nhân mới có khả năng cốđịnh N2, đó là 11 trong 47 họ vi khuẩn và 6 trong 8 họ vi khuẩn lưu huỳnh. Một số sống tự do, một số sống cộng sinh với thực vật bậc cao. Những vi sinh vật cố định đạm quan trọng nhất là:
- Rhizobium, sống cộng sinh với cây họđậu.
- Bradyrhizobium, cũng sống cộng sinh với cây họđậu, chúng khác với rhizobiumở chỗ là sinh trưởng chậm hơn.
- Loài frankia, vi khuẩn sống trong đất.
- Vi khuẩn lưu huỳnh heterocysten sống cộng sinh với các loài thực vật khác nhau như với bèo hoa dâu (azolla) ở lá.
Những loài vi sinh vật sống cộng sinh và tự do có chứa gen Nif trong hệ gen (Ni là viết tắt của nitrogen và f là fixing). Gen này mã hoá cho enzyme nitrogenase, là một đa enzyme, xúc tác cho phản ứng cố định N2, khử N2 thành NH3. Nitrogenase gồm 2 protein chứa Fe-S, protein nhỏ
hơn có trọng lượng phân tử 60 kDa, chứa 1 chùm Fe-S có 4 nguyên tử, phân tử protein lớn hơn có trọng lượng phân tử 220 kDa và chứa nguyên tử S linh động, 36 nguyên tử Fe và 2 nguyên tử Mo. Phân tử protein nhỏ
hơn có chức năng vận chuyển e-, trong đó e- của ferredoxin hoặc flavodoxin vận chuyển lên phức hệ Fe-Mo (hình 7.16).
Sự vận chuyển e- này cần năng lượng, do ATP cung cấp. ATP kết hợp với protein chứa Fe qua 1 cầu Mg và sau đó được thuỷ phân thành ADP và Pi. Sự thuỷ phân đã làm thay đổi hình dạng của protein enzyme, e- được vận chuyển lên phức hệ Fe-Mo. Để vận chuyển 1e- cần 2 ATP. Phức hệ Fe-Mo thực chất là 1 N2-reductase. Phức hệ nhỏ hơn được gạch chéo là 1 protein chứa Fe, phức lớn hơn là protein chứa Fe/Mo, phức lớn này thực chất là dinitrogen-reductase (hình 7.16).
Hình 7.16 Các phản ứng xảy ra ở bacteroid của vi khuẩn rhizobium
Để vận chuyển e- từ phức Fe/Mo đến N2 thì sự thay đổi hoá trị Mo có một vai trò quan trọng, nhưở hình 7.17.
1. 2e- và 2H+được kết hợp với nguyên tử Mo
2. Nguyên tử H2đang gắn với enzyme bịđẩy ra bởi N2 3. N2được khử thành -N=N do tiếp nhận H+ + e- 4. -N=N được khử thành =N-NH2 do tiếp nhận H+ + e-
5. =N-NH2 được khử thành NH3 do tiếp nhận H+ + e-, NH3được tách ra khỏi phức hệ enzyme
6. Nguyên tử N đang gắn với enzyme được khử thành NH3 do tiếp nhận 3e- và 3H+ và sau đó NH3được tách ra khỏi phức hệ.
Sự gắn N2 với phức hệ Fe-Mo cần 1 liên kết trước đó của phức hệ
này với H2. Vì vậy kết quả là bên cạnh tạo ra NH3 ngoài ra còn xuất hiện H2, phân tử này có thểđược tách ra thành H+ và e- và e- này được đưa trở
Tổng quát: 8H+ + 8e- + N2 → H2 + 2NH3
Hình 7.17 Sự khử N2 thành NH3ở phức hệ Fe-Mo của nitrogenase
Ở rhizobium và bradyrhizobium hệ thống nitrogenase được biểu diễn ở hình 7.15, hệ thống này định vị ở bacteroid được tìm thấy trong “không bào nhiễm” của những tế bào nốt sần. Bacteroid tương tự một cơ
quan và có thể so sánh với ty thể. Nó được cung cấp các hợp chất carbon hữu cơ, chủ yếu là anion hữu cơ (succinate, malate, pyruvate) bởi tế bào chất của ký chủ, những chất này được tiếp tục phân giải trong chu trình Krebs. Ởđây xuất hiện NADH, được sử dụng một phần là chất cho điện tử
ferredoxin và flavodoxin, một phần được sử dụng làm nguyên liệu của hô hấp. Hệ thống oxy hoá khử của chuỗi hô hấp cấu tạo nên màng. Chúng cung cấp ATP và ATP cần cho sự hoạt hoá enzyme nitrogenase. Chuỗi hô hấp được cung cấp O2 bởi leghemoglobin. Phức hệ protein chứa heme có trong không bào nhiễm này có thể so sánh với myoglobin trong mô cơ
hoặc hemoglobin trong máu. Nó cung cấp O2 cho chuỗi enzyme hô hấp và nó kiểm soát O2 đi vào bacteroid. Sự kiểm soát này rất quan trọng, vì enzyme này bịức chế bởi O2.
NH3 được tạo nên bởi nitrogenase được đưa đến tế bào chất của tế
bào chủ và ởđây được sử dụng để tổng hợp nên aminoacid. Sự tổng hợp enzyme nitrogenase được điều khiển bởi enzyme glutamate synthetase, xúc tác cho tổng hợp glutamin từ NH3. Nếu trong hệ thống có ít NH3 thì
glutamate synthetase kích thích tổng hợp nitrogenase, nồng độ NH3 cao thì
ức chế sự tổng hợp nitrogenase. Cơ chếđiều khiển này rất có ý nghĩa, tuy nhiên khi cung cấp NH3 dư thừa thì nitrogenase không được sử dụng, vì đã có đủ NH3. Vì vậy bón phân đạm ức chế sự tạo thành nốt sần của cây họ đậu. Ở vi khuẩn rhizobium sống cộng sinh, NH3 tạo thành được đưa nhanh
đến tế bào chủ, nên sự tổng hợp nitrogenase hầu như không bị kìm hãm. Hơn nữa vi khuẩn trong tế bào chủ luôn được cung cấp bởi những anion hữu cơ. Đó là những nguyên nhân quan trọng nhất, tại sao sự cộng sinh vi khuẩn/cây họ đậu có tỷ lệ cố định N2 cao. Ví dụ cây cỏ (trifolium pratence) sống cộng sinh với vi khuẩn trong điều kiện sinh trưởng tốt có thể cố định 300-400 kg N/ha/năm. Vi khuẩn sống tự do tỷ lệ cố định nitơ
bị ảnh hưởng do sự tích luỹ NH3 ở trong tế bào vi khuẩn và sự cung cấp không đầy đủ carbon hữu cơ. Loài vi khuẩn cố định nitơ sống tự do cần cho sự trao đổi chất của chúng những hợp chất hữu cơ dễ phân giải, như đường và các acid hữu cơ, thường có trong đất với lượng không đủ. Vì vậy khả năng cốđịnh đạm của vi khuẩn sống tự do cơ bản là thấp. Những vi khuẩn lưu huỳnh tự dưỡng thuộc loài anabaena, nostoc và rivularia tự đồng hoá CO2 bằng quang hợp và cốđịnh N2. Khả năng cốđịnh N2 bịảnh hưởng rất nhiều khi nồng độ O2 cao.