1.5.1. Phơng pháp sắc ký khí.
Trong hoá hữu cơ có khoảng 80% các hợp chất đợc phân tích bằng sắc ký khí.
1.5.1.1. Bản chất của phơng pháp sắc ký khí.
Sắc ký khí là một quá trình dựa trên cơ sở chuyển dịch một lớp gián đoạn chất dọc lớp chất hấp hấp thụ trong một dòng pha dộng và liên hệ với sự lặp lại nhiều lần các giai đoạn hấp thụ và giải hấp thụ.
Quá trình sắc ký xảy ra khi có sự phân bố hấp thụ chất giữa hai pha, trong đó một pha chuyển dịch so với pha kia. Nói cách khác cơ sở của sắc ký khí là quá trình hấp thụ hoặc hấp thụ với quá trình giải hấp.
Nguyên tắc của sắc ký khí dựa trên sự phân chia các thành phần chất cần phân tích vào hai pha không trộn lẫn vào nhau. Pha cố định (pha tĩnh) là chất lỏng hoặc chất rắn đợc tẩm lên trên bề mặt của chất mang (cột nhồi) hoặc tráng thành lớp mỏng trong lòng cột tách (cột mao quản). Pha động là chất khí (H 2, He, Ar, N 2).
Khi đa vào cột một hỗn hợp cần phân tích, muốn đạt đợc mức độ tách hoàn toàn trớc hết bề mặt tiếp xúc giữa hai pha phải đủ lớn (do quá trình khuyếch tán chất, sẽ làm giảm hiệu quả tách) và sau cùng là sự chuyển dịch h- ớng của một pha (pha động) so với pha kia (pha tĩnh) nh thế nào đó để mỗi cấu tử trong hỗn hợp đợc phân bố giữa hai pha phù hợp với tính chất hấp phụ hoặc hấp thụ của nó.
Do pha động chuyển dịch liên tục nên ngoài nhiệm vụ đa các chất lên mặt pha tĩnh. Nó còn tiếp nhận các phần tử chất phân tích đã đợc hấp thụ trớc đó đợc giải hấp phụ tới tơng tác với phần khác của bề mặt pha tĩnh. Nói cách khác đó là quá trình chuyển chất từ đĩa lý thuyết này đến đĩa lý thuyết khác mà tồn tại một cân bằng. Quá trình chuyển chất trên các đĩa lý thuyết diễn ra liên tục giữa pha tĩnh và pha động; chuyển dịch từ đầu cột đến cuối cột kéo theo sự phân vùng riêng biệt (có màu hoặc không màu) các chất trong cột sắc ký. Nếu bằng một cách nào đó, ta ghi đợc sự phân bố nồng độ các chất dọc theo cột ta thu đợc một đờng cong gọi là sắc phổ (hay gọi là sắc ký đồ).
Lu Thị Thuỷ Lớp 45E Hoá-Khoa Hoá Học31
A+B B+E A+E E E E E A B A B A B
Hình 1: Mô tả quá trình tách chất trên sắc ký khí.
Từ sắc đồ để phân tích thành phần của hỗn hợp có thể dùng các phơng pháp sau:
Dựa vào giá trị thời gian lu Rt (thời gian lu của một chất là thời gian của chất đó đợc lu trong cột tách tính từ khi bơm mẫu vào máy đến khi phát hiện ở đetectơ, tính bằng phút). So sánh thời gian lu của chất chuẩn ta sẽ nhận ra chất cần phân tích. Tuy vậy phơng pháp này có thể gây nhầm lẫn vì có nhiều thành phần khác nhau nhng thời gian lu lại nh nhau vì thế cần phải tiến hành so sánh trên nhiều cột tách có tính chất khác nhau (phân cực hoặc không phân cực).
Phơng pháp phân tích cộng: Trộn chất cần so sánh vào tinh dầu và tiến hành sắc ký, so sánh hai bản sắc ký đồ thu đợc, đỉnh của chất dự kiến sẽ tăng lên nhiều so với bản sắc ký nguyên mẫu.
Phơng pháp phân tích trừ: Loại chất cần phân tích bằng phơng pháp hoá học, so sánh với hai bản sắc ký đồ tinh dầu nguyên mẫu và tinh dầu đã loại chất cần định tính. ở sắc đồ thứ hai đỉnh nó sẽ mất đi hoặc còn lại rất nhỏ. Phơng pháp này có thể áp dụng để định tính các thành phần: Phenol, Andehit, Xeton.
Phơng pháp chuyển dịch đỉnh: Tạo các chất mới bằng các phản ứng hoá học xảy ra với chất dự kiến định tính. So sánh hai sắc ký đồ ở bản thứ hai, đỉnh của chất dự kiến bị mất đi, xuất hiện thêm một đỉnh mới. Phơng pháp này thờng
Kết hợp giữa sắc ký khí với các phơng pháp phân tích phổ: Đây là phơng pháp dùng rất phổ biến, có ứng dụng rất lớn. Ví dụ: sắc ký khí kết hợp với sắc khối phổ khí (GC/MS), sắc khí ký kết hợp với phổ hồng ngoại.
Hình 2: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí
Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách (5) và detectơ (6). Nhờ có khí mang đợc cha trong bình bom (1), mẫu từ buồng bay hơi đợc dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt, quá trình sắc ký xảy ra ở đây. Sau khi rời bỏ cột tách tại các thời điểm khác nhau. Các cấu tử lần lợt vào detectơ tại đó chúng đợc chuyển thành tín hiệu, tín hiệu này đợc khuếch đại ở (7) rồi, hoặc chuyển sang bộ phận ghi (8) ở loại máy đơn giản hoặc chuyển sang tích phân kế có gắn máy tính (9) các tín hiệu đợc xử lý rồi chuyển sang bộ phận kết quả (loại máy hiện đại).
Phơng pháp sắc ký khí dùng để tách các hợp chất có thể bay hơi ở nhiệt độ cao mà không bị phân huỷ kết quả phân tích. Sắc ký khí có thể cung cấp nhiều kết luận bổ ích về cấu trúc của các hợp chất.
Phơng pháp sắc ký khí cho phép phân tích định tính và định lợng nhanh chóng các thành phần cũng nh thực hiện việc tách điều chế các hỗn hợp chất. Khả năng tách của phơng pháp sắc ký khí tốt, nhanh. Nó có thể tách nhiều hỗn hợp mà các kỹ thuật khác (sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, cất phân đoạn) không giải quyết đợc.
Kỹ thuật tơng đối đơn giản, dễ vận hành, cho kết quả nhanh. Độ nhạy của sắc ký khí cao. Các máy thông thờng có thể xác định đợc đến 0,01% chất thử. Với loại máy tinh vi hơn có thể phân tích với lợng một phân tử gam.
1.5.2. Phơng pháp khối phổ.
Khối phổ là phơng pháp phân tích mà trong đó một hợp chất xét nghiệm đợc ion hoá và phá thành các mảnh nhỏ trong thể tích khí dới dạng chân không cao 10-6mmHg. Sau quá trình ion hoá các điện tích đó đợc giá tốc trong điện tr- ờng. Đợc tách một từ trờng theo cờng độ của các hạt đó.
Quá trình ion hoá đợc thực hiện bằng cách cho một dòng electron có tốc độ cao va đập vào một mẫu hợp chất hữu cơ trong thể hơi và ion hoá hoá họcn phân tử đợc tạo thành.Trong quá trình này thông thờng một (hoặc hai) electron của lớp ngoài bị bật ra khỏi phân tử và ion phân tử đợc tạo thành.
M+ + 2e M + e M2+ + 3e
Để tách một electron nh vừa nói thì động năng của electron va đập ít nhất phải tơng ứng thế ion hoá của phân tử, tức là khoảng 8 – 15 ev.
Nếu trong quá trình đó một phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lợng lớn (lớn hơn năng lợng cần thiết để ion hoá) thì khi đó phân tử đợc chuyển giao nhiều năng lợng đến mức các ion hoá phân tử đợc hình thành bị phá ra thành các mảnh nhỏ gọi là quá trình phân mảnh. Trong quá trình này một ion
M+ → F0 + F+
Rồi các mảnh đó tiếp tục bị phá để cho một loạt các tiểu phân khác. Trong quá trình ion hoá nói trên, các ion phân tử, các ion mảnh hoặc các ion tiểu phân không có điện tích (ví dụ: gốc) đợc u tiên tạo thành trớc.
Dới những điều kiện đã cho xác suất để tạo thành những ion có điện tích âm thấp hơn 104 lần.
Phơng pháp phổ khối lợng dựa trên nguyên tắc chung là tách và đo khối l- ợng của tất cả các ion và ghi chúng trên một bản phổ. Sau đó dựa vào quy luật chung để phân tích thành phần các chất theo bản phổ ghi đợc.
Về kỹ thuật, quá trình phân tích khối phổ phải thực hiện qua các bớc sau: Hoá khí mẫu phân tích, ion hoá mẫu, tách các ion theo khối lợng, ghi nhận các ion, xử lý số liệu.
Nói chung phổ khối lợng đợc ghi lại dới dạng phổ vạch hoặc dới dạng các bảng, trong đó cờng độ của các đỉnh đợc đo bằng phần trăm so với cờng độ đỉnh cao nhất (gọi là đỉnh cơ sở). Thờng là đỉnh cao nhất trong nhóm các đỉnh có số khối lợng cao nhất của phổ (vì m/e ˜ m), vì vậy đỉnh này tơng đơng với khối l- ợng phân tử chính xác của hợp chất khảo sát. Do đó, để đánh giá khối phổ của một hợp chất cha biết, ta phải bắt đầu giải thích đỉnh có số khối lợng cao nhất. Các đỉnh của những mảnh bền hoá hơn là các đỉnh có khối lợng thấp. Đối với một chất sẽ cho ta nhận đợc một phổ các mảnh điển hình (mảnh chìa khoá) và căn cứ vào mô hình phân huỷ để ráp lại các mảnh đó, sẽ cho phép ta suy ra cấu chất của hợp chất khảo sát.
Hình 3: Giản đồ một khối phổ kế.
Phơng pháp phổ khối lợng có u điểm nổi bật là độ nhạy cao hơn các kỹ thuật phân tích khác, đặc biệt rất hữu ích trong việc nhận dạng hợp chất cha biết và khẳng định sự có mặt của hợp chất đã biết, đồng thời nó là phơng pháp duy nhất đa ra trọng lợng phân tử chính xác.
Việc kết hợp phơng pháp sắc ký khí với phơng pháp khối phổ đã tạo ra phơng pháp phân tích mới (phơng pháp GC/MS) có ý nghĩa rất lớn ngày càng đ- ợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
Phần II. Thực nghiệm. 2.1. Lấy mẫu vỏ bởi.
2.1.1. Mẫu 1. ( ký hiệu TB1).
a. Đặc điểm mẫu 1: Mẫu vỏ bởi đợc lấy tại huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long còn đợc gọi là bởi Năm Roi.
Cây bởi Năm Roi cao trung bình từ 7 - 8 m, cao nhất có thể 15 m, có gai dài khoảng 2,5 cm có khi tới 4cm nếu sinh sản bằng hột và không có gai hoặc gai rất ngắn nếu sinh sản sinh dỡng. Khi còn non thì gai có lông tơ. Lá có hình từ oval tới hình elíp, kích thớc trung bình từ 5-10 x 2-5 cm, có khi tới 20 x 12 cm, đế hình tròn hoặc gần hình tim, lá thuộc kiểu lá kép biến dạng. Dạng quả Lê, nhng đạt kích thớc lớn, trung bình mỗi trái nặng 1,8kg và năng suất tơng đối ổn định. Tép bởi Năm Roi rất dễ bóc tách khỏi múi, rất mọng nớc và ngọt thanh. Điểm đặc trng của giống bởi này là đa số không có hạt.
b. Phơng pháp lấy mẫu.
Chọn những quả chín, vào các ngày khô ráo.
c. Ngày lấy mẫu. Ngày 06/11/2008.
2.1.2. Mẫu 2. ( ký hiệu TB2). a. Đặc điểm mẫu 2:
Mẫu vỏ bởi đợc lấy tại xã Nam Giang, huyện Đô Lơng, tỉnh Nghệ An. Đặc điểm của cây bởi không to bằng các giống bởi khác, quả bởi có núm nhô cao, hình dạng trông giống quả lê lớn. Khi chín vỏ vàng rộm, tép nhỏ, màu phớt hồng, ăn có vị the, ngọt.
b. Phơng pháp lấy mẫu.
Chọn những quả chín, vào các ngày khô ráo.
c. Ngày lấy mẫu. Ngày 15/11/2008.
Mẫu đợc lấy đem bỏ vào túi sẫm màu để vận chuyển, sau đó rửa sạch cho vào túi bóng và tốt nhất là chng cất ngay (để đảm bảo độ chính xác của tinh dầu).
Tuy nhiên vỏ bởi có thể bảo quản đợc từ 1- 2 ngày bằng cách tải mỏng để nơi thoáng mát rồi mới chng cất.
2.3. Định lợng tinh dầu. 2.3.1. Hoá chất. Natrisunfat khan: Na2SO4. 2.3.2. Dụng cụ-Thiết bị máy móc. - ống sinh hàn ruột gà - Nồi áp suất
- Xiranh (để hút tinh dầu) - Bình định mức, bình tam giác
- Các lọ tiêu chuẩn để bảo quản tinh dầu - Bếp điện
- Máy sắc kí khí (GC) và máy sắc kí khí-khối phổ liên hợp (GC-MS).
2.3.3. Tách tinh dầu.
Để tách tinh dầu lá, hoa, vỏ bởi ta có thể dùng nhiều phơng pháp. Ngời ta thờng dùng phơng pháp ép để lấy tinh dầu từ vỏ quả và lá bởi và dùng phơng pháp ớp để lấy tinh dầu từ hoa. Tuy nhiên nếu dùng phơng pháp ép để lấy tinh dầu từ vỏ và lá thì đòi hỏi lợng nguyên liệu phải nhiều và tinh dầu thu đợc thờng bị vẩn đục, xen lẫn vào nhiều chất nhầy và các tạp chất khác. Chính vì thế để tách tinh dầu vỏ bởi chúng tôi lựa chọn phơng pháp chng cất lôi cuốn hơi nớc.
2.3.3. 1. Thí nghiệm tách tinh dầu.
Để tách tinh dầu vỏ bởi chúng tôi chọn phơng pháp chng cất lôi cuốn hơi nớc, với bộ dụng cụ gồm: nồi cất (nồi áp suất), ống sinh hàn ruột gà, bình định mức lắp nh hình 4.
Hình 4: Sơ đồ bộ dụng cụ tách tinh dầu bằng phơng pháp chng cất lôi cuốn hơi nớc.
a. Tiến hành chng cất tinh dầu.
Mẫu thứ nhất chúng tôi lấy 5 kg cho vào nồi áp suất (dung tích 5 lít), cho vào nồi khoảng 2500 ml nớc cất. Đun bằng bếp điện.
Khi có dịch ngng điều chỉnh nhiệt độ bếp điện sao cho tốc độ giọt vừa phải.
Thời gian định lợng tinh dầu vỏ bởi mẫu thứ nhất là 3 giờ kể từ khi bắt đầu có dịch ngng.
Mẫu thứ hai chúng tôi lấy 3,5 kg cho vào nồi áp suất (dung tích 5 lít), cho vào nồi khoảng 2000 ml nớc cất. Đun bằng bếp điện.
Khi có dịch ngng điều chỉnh nhiệt độ bếp điện sao cho tốc độ giọt vừa phải.
Thời gian định lợng tinh dầu vỏ bởi mẫu thứ hai là 3 giờ kể từ khi có dịch ngng.
b. Chiết tinh dầu.
Sau khi lấy đợc tinh dầu có lẫn nớc, do tỉ trọng của tinh dầu nhẹ hơn nớc nên tinh dầu nổi lên trên và phân thành lớp. Lấy xiranh hút tinh dầu ở lớp trên cho vào bình chuẩn đựng tinh dầu.
2.3.3.2. Cách làm khô và bảo quản tinh dầu.
Tinh dầu thu đợc ở trên thờng có lẫn một ít nớc nên cần làm khô bằng cách cho một ít tinh thể Na2SO4 khan vào lọ đựng tinh dầu rồi để yên một thời gian
(10 - 15 phút ), sau đó hút lấy phần tinh dầu sang lọ tiêu chuẩn và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ dới 5 0C trớc khi đem phân tích.
2.3.4. Phơng pháp định lợng tinh dầu. Hàm lợng tinh dầu đợc tính theo công thức:
a * 100 X ( % ) =
b
Trong đó: X%: Tỉ lệ phần trăm tinh dầu đối với nguyên liệu tơi. a : Thể tích tinh dầu (ml) thu đợc
b : Khối lợng nguyên liệu (g).
2.4. Xác định thành phần hoá học của tinh dầu.
Thành phần hoá học của tinh dầu vỏ bởi đợc xác định bằng phơng pháp sắc ký khí (GC) và sắc ký khí - khối phổ ký liên hợp (GC/MS).
Sắc ký khí (GC):
Đợc thực hiện trên máy HP 6890 Plus Gas Chromatogaph gắn với detector FID và đợc tách bằng cột HP - 5MS có kích thớc 30m x 0,25 mm, lớp phim dày 0,25àm.
Điều kiện phân tích: khí mang heli, nhiệt độ buồng bơm mẫu 2000C, nhiệt độ detector 2600C, chơng trình nhiệt độ cho cột phân tích từ 60 0C (2 phút ) đến 220 0C (10 phút) với tốc độ 4 0C/ phút.
Sắc ký khí - khối phổ ký liện hợp (GC/MS ):
Đợc thực hiện bằng hệ thống thiết bị Hewlett Packard 6890 Plus Gas Chromatogaph đợc ghép với khối phổ ký HP 5970 N (70 ev) và đợc tách bằng cột HP - 5MS, kích thớc 30 m x 0,25 mm, lớp phim dày 0,25àm.
Điều kiện phân tích: khí mang heli, nhiệt độ buồng bơm mẫu 2000C, nhiệt độ detector 2600C, chơng trình nhiệt độ cho cột phân tích từ 600C (2 phút) đến 220 0C (10 phút) với tốc độ 4 0C/ phút.
Các cấu tử đợc nhận dạng bằng cách so sánh khối phổ của chúng với khối phổ có trong th viện phổ: Nist 02. L, Flavor 2. L.
Phần IiI: Kết quả và thảo luận. 3.1.Tinh dầu vỏ quả bởi ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long.
3.1.1. Định lợng tinh dầu.
Vỏ bởi đợc lấy vào ngày 06/11/2008 tại huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long.
Chng cất ngày: 10/11/2008.
Lấy 5kg vỏ quả bởi chng cất trong vòng 3 giờ thu đợc 4ml tinh dầu. Hàm lợng tinh dầu trong vỏ quả bởi ở mẫu TB1 là 0,08% so với mẫu tơi.
Tinh dầu vỏ quả bởi thu đợc là chất lỏng trong suốt, nhẹ hơn nớc, có mùi thơm đặc trng.
3.1.2. Thành phần hoá học.
Để xác định thành phần hoá học của tinh dầu vỏ quả bởi chúng tôi sử dụng phơng pháp sắc kí khí - khối phổ kí liên hợp (GC/MS) thu đợc sắc kí đồ của tinh dầu vỏ bởi mẫu TB1 nh hình 5: