Mẫu tơi đợc lấy vào buổi sáng. Sau khi lấy về rửa sạch, chặt nhỏ sau đó ngâm qua etanol 900 rồi phơi bóng râm cho đến khô. Việc xử lý tiếp mẫu bằng ph- ơng pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đợc hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu đợc nêu ở phần thực nghiệm.
2.1.2. Phơng pháp phân tích, tách và phân lập các chất.
Các phơng pháp sử dụng trong quá trình phân tích, tách và phân lập các chất là:
*) Sắc ký cột thờng sử dụng silicagel cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm (254 - Merck). *) Sắc ký lớp mỏng (TLC).
*) Các phơng pháp kết tinh phân đoạn.
2.1.3. Phơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất.
Cấu trúc của các hợp chất đợc khảo sát nhờ sự kết hợp giữa các phơng pháp phổ:
*) Phổ khối lợng EI - MS đợc ghi trên máy HP 5989 B - MS. Năng lợng bắn phá ở 70eV.
*) Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR đợc đo trên máy Bruker 500 MHz, dung môi CDCl3.
*) Phổ 13C - NMR, DEPT đợc đo trên máy BRUKER 125 MHz, dung môi CDCl3.
*) Phần mềm phổ mô phỏng ACD/HNMR BD.
(Các phổ trên đều đợc đo tại Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
2.2. Thực nghiệm.2.2.1. Thiết bị và hóa chất. 2.2.1. Thiết bị và hóa chất. 2.2.1.1. Thiết bị. *) Cột sắc ký thờng (chiều dài 1,4 m; đờng kính 4,5 cm). *) Bộ chng cất thờng. *) Các thiết bị đo phổ *) Các vật dụng cần thiết khác 2.2.1.2. Hoá chất. *) Axit sunfuric. *) Axeton. *) Butanol. *) Clorofom.
*) Các dung môi đo phổ *) Etylaxetat. *) Metanol. *) n-Hexan. *) Nớc cất. *) Iốt. *) Silicagel. 2.2.2. Tách và xác định cấu trúc hợp chất. 2.2.2.1. Tách các hợp chất. a) Thu hái mẫu.
Vỏ cây vối đợc lấy vào tháng 2 năm 2008 ở thành phố Vinh, tỉnh Nghệ An. Mẫu sau khi lấy về đợc rửa sạch, chặt nhỏ sau đó đợc xử lí qua etanol 960 (nhằm tiêu diệt một số vi khuẩn và men gây mốc) và phơi trong bóng râm cho đến khô, thu đợc 5kg mẫu khô.
b) Chiết và tách các hợp chất từ vỏ cây vối.
Vỏ cây vối sau khi làm khô đợc ngâm trong metanol trong thời gian 30 ngày. Lọc dịch chiết và cất thu hồi dung môi thu đợc cao metanol.
Cao metanol đợc phân tán vào trong nớc cất sau đó lần lợt chiết với các dung môi n-hexan, clorofom, etylaxetat, butanol. Cất thu hồi dung môi thu đợc các cao n-hexan, cao clorofom, cao etylaxetat, phần dịch chiết butanol và phần cặn. Cao etylaxetat (80g) trộn đều với silicagel theo tỉ lệ 1 : 1 rồi cho vào cột sắc ký pha tĩnh là silicagel cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (254 - Merck). Tiến hành sắc ký với hệ dung môi rửa giải là clorofom : metanol với tỉ lệ tăng dần độ phân cực, lấy lần lợt các thể tích xác định (80 ml) chảy ra khỏi cột, cất thu hồi dung môi một phần rồi cho bay hơi tự nhiên thu đợc các phân đoạn tơng ứng ở bảng sau:
Bảng 2.1. Số liệu quá trình chạy cột cao etyl axetat vỏ vối STT Hệ dung môi CHCl3/CH3OH Tỉ lệ Phân đoạn
1 CHCl3/CH3OH 100 : 0 1 : 10 2 CHCl3/CH3OH 98 : 2 10 : 20 3 CHCl3/CH3OH 95 : 5 21 : 40 4 CHCl3/CH3OH 90 : 10 41 : 70 5 CHCl3/CH3OH 85 : 15 71 : 85 6 CHCl3/CH3OH 80 : 20 86 : 110 7 CHCl3/CH3OH 75 : 25 111 : 130 8 CHCl3/CH3OH 70 : 30 131 : 160 9 CHCl3/CH3OH 65 : 35 161 : 180 10 CHCl3/CH3OH 60 : 40 181 : 200
Tại hệ dung môi 90:10 tơng ứng với phân đoạn 54, 55, 56 xuất hiện một lợng lớn chất rắn màu trắng nhạt. Thử SKLM cho thấy có sự tơng đồng nên chúng tôi chọn một chất (ở phân đoạn 55) để làm sạch. Thử hoà tan chất này trong axeton thì thấy tan ít nên axeton đợc dùng để rửa chất bẩn. Sau khi đợc rửa nhiều lần với axeton, chất rắn đợc kết tinh nhiều lần trong dung môi metanol và thu đợc một hợp chất tơng đối sạch, kí hiệu là TDVV11. Thử SKLM chất này thấy có 2 vệt. Kết tinh lại nhiều lần và thử SKLM nhng không thể tách đợc 2 vệt này nên dự đoán là một hỗn hợp đồng phân.
Mẫu khô (5kg)
Ngâm trong metanol 30 ngày Cất thu hồi dung môi
Phân tán vào nớc
Chiết với các dung môi và cất thu hồi dung môi. n-hexan clorofom etylaxetat butanol
Nhồi cột
Rửa giải bằng dung môi clorofom : metanol
Sơ đồ 2.1. Phân lập các hợp chất từ vỏ cây vối
2.2.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất.
Để xác định cấu trúc các hợp chất, chúng tôi sử dụng kết hợp các phơng pháp phổ:
Bã mẫu Cao
metanol
Cao
n-hexan clorofomCao Cao
etylaxetat (80g) Dịch chiết butanol Hệ dung môi 90 : 10 Hợp chất TDVV11
*) Phổ khối lợng EI - MS đợc ghi trên máy HP 5989 B - MS. Năng lợng bắn phá ở 70 eV.
*) Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR đợc đo trên máy Bruker 500 MHz, dung môi CDCl3.
*) Phổ 13C - NMR, DEPT đợc đo trên máy BRUKER 125 MHz, dung môi CDCl3.
(Các phổ trên đều đợc đo tại Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
Chơng 3
Kết quả và thảo luận
Hợp chất TDVV11 có dạng vô định hình màu trắng. Hợp chất này khi thử trên bản mỏng thấy hiện lên 2 vết nên có khả năng là hỗn hợp đồng phân của 2 chất A và B.
3.1. Xác định cấu trúc hợp chất A trong mẫu TDVV11.
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR (hình 3.1; 3.2)
Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR của hợp chất A có những tín hiệu cộng hởng đặc trng nh sau:
Proton vinylic (H12) có độ chuyển dịch hoá học δ = 5,25 ppm.
Proton của nhóm CH - OH (H2) có độ chuyển dịch hoá học δ = 3,72 ppm.
Proton của nhóm CH - OH (H3) có độ chuyển dịch hoá học δ = 3,56 ppm, J = 10,5Hz.
Bảy nhóm CH3 có các tín hiệu cộng hởng với độ chuyển dịch tơng ứng δ
(ppm): 1,02 (s) (H23); 0,93 (s) (H24); 0,78 (s) (H25); 0,82 (s) (H26); 1,14 (s) (H27); 0,86 (d), J = 6,0 Hz (H29); 0,95 (d), J = 6,0 Hz (H30).
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C - NMR (hình 3.3; 3.4; 3.5)
Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất A có các tín hiệu đặc trng sau:
Tín hiệu cộng hởng của nguyên tử cacbon của nhóm axit (C28) có δ = 180,6 ppm.
Tín hiệu cộng hởng của các nguyên tử cacbon của liên kết đôi: δ = 125,4 ppm (C12), δ = 138,5 ppm (C13).
Độ chuyển dịch hoá học của các nguyên tử cacbon của nhóm CH - OH:
Chi tiết các số liệu phổ của hợp chất A đợc thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Số liệu cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR và 13C - NMR của hợp chất A.
TT Nhóm C 13C - NMR δ (ppm) 1H - NMR δ (ppm)
Thực nghiệm Tài liệu Thực nghiệm Tài liệu
1 CH2 46,5 47,9 2 CH - OH 68,5 68,6 3,72 (m) 4,12(m) 3 CH- OH 79,8 83,8 3,56 (d) J = 10,5 Hz 3,42(d) J = 9,4Hz 4 C 38,3 40,0 5 CH 48,8 55,9 6 CH2 18,4 18,8 7 CH2 32,7 33,2 8 C 42,0 39,8 9 CH 47,7 48,1 10 C 38,2 38,4 11 CH2 23,6 23,7 12 CH 125,4 125,5 5,25 (br s) 5,48(br s) 13 C 138,5 139,3 14 C 42,3 42,5 15 CH2 28,2 28,6 16 CH2 24,4 24,9 17 C 48,0 48,0 18 CH 53,0 53,5 2,20 (br d) J = 10,0 Hz 2,64(br d) J = 11,4Hz 19 CH 39,5 39,4 20 CH 39,3 39,3 21 CH2 30,8 31,0 22 CH2 37,0 37,4 23 CH3 23,7 29,4 1,02 (s) 1,29(s) 24 CH3 23,5 17,7 0,93 (s) 1,09(s) 25 CH3 17,0 16,9 0,78 (s) 0,99(s) 26 CH3 17,0 17,5 0,82 (s) 1,06(s) 27 CH3 23,7 23,9 1,14 (s) 1,22(s) 28 C = O 180,6 179,9 29 CH3 17,2 17,5 0,86 (d) J = 6,0 Hz 1,00(d) J = 4,9Hz 30 CH3 21,2 21,4 0,95 (d) J = 6,0 Hz 0,96(d) J = 5,9Hz
Từ số liệu phổ 1H - NMR và 13C - NMR, kết hợp với phổ mô phỏng 1H - NMR và so sánh với tài liệu [29] đã xác định đợc cấu tạo của hợp chất A là axit 2α ,3β - dihydroxy - urs-12-en-28-oic. Công thức cấu tạo:
H3C 1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 23 CH3 COOH O H CH3 8 CH3 C H3 CH3 CH3 O H
3.2. Xác định cấu trúc hợp chất B trong mẫu TDVV11.
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR (hình 3.6; 3.7)
Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR có những tín hiệu cộng hởng đặc trng nh sau:
Proton của liên kết đôi (H12) có độ chuyển dịch hoá học δ = 5,28 ppm. Proton của nhóm CH - OH (H3) có độ chuyển dịch hoá học δ = 3,34 ppm.
Hai proton của nhóm CH2 - OH (H23): proton 23a có độ chuyển dịch hoá học δ = 3,39 ppm; proton 23b có độ chuyển dịch hoá học δ = 3,37 ppm, J = 11 Hz.
Sáu nhóm CH3 có độ chuyển dịch hoá học δ (ppm): 0,82 (s) (H24); 1,03 (s) (H25); 1,09 (s) (H26); 1,27 (s) (H27); 0,90 (s) (H29); 1,00 (s) (H30).
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C - NMR (hình 3.8; 3.9; 3.10)
Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất B có các tín hiệu đặc trng sau:
Tín hiệu cộng hởng của nguyên tử cacbon của nhóm axit (C28) có δ = 180,6 ppm.
Độ chuyển dịch hoá học của các nguyên tử cacbon của liên kết đôi: δ = 122,2 ppm (C12), δ = 144,1 ppm (C13).
Nguyên tử cacbon của nhóm CH - OH (C3) có độ chuyển dịch hoá học δ
= 79,8 ppm; của nhóm CH2 - OH (C23) có độ chuyển dịch hoá học δ = 69,3 ppm.
Chi tiết các số liệu phổ của hợp chất B đợc thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Số liệu cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR và 13C - NMR của hợp chất B.
TT Nhóm C 13C - NMR δ (ppm) 1H - NMR δ (ppm)
Thực nghiệm Tài liệu Thực nghiệm Tài liệu
1 CH2 39,1 39,3 2 CH2 27,8 26,5 3 CH- OH 79,8 81,3 3,34(m) 4,29(m) 4 C 42,6 43,8 5 CH 49,9 47,9 6 CH2 17,1 18,4 7 CH2 32,5 33,2 8 C 39,7 40,0 9 CH 49,0 48,5 10 C 39,1 37,2 11 CH2 23,5 24,0 12 CH 122,2 122,6 5,28(br s) 5,49(br s) 13 C 144,1 145,5 14 C 42,3 42,4 15 CH2 29,2 28,7 16 CH2 23,2 24,0 17 C 46,3 46,9 18 CH 41,4 42,4 19 CH2 46,1 47,0 20 C 31,8 31,2 21 CH2 34,1 34,6 22 CH2 32,5 33,6 23 CH2 - OH 69,3 64,4 (23a) 3,39 (23b) 3,37, J= 11,0Hz (23a) 4,28 (23b) 3,93, J= 10,0Hz 24 CH3 12,9 14,4 0,82(s) 1,14(s) 25 CH3 12,9 16,4 1,03(s) 1,01(s) 26 CH3 17,1 17,9 1,09(s) 1,04(s) 27 CH3 26,0 26,4 1,27(s) 1,26(s) 28 C = O 180,6 182,0 29 CH3 33,1 33,1 0,90(s) 0,93(s) 30 CH3 23,6 23,9 1,00(s) 1,06(s)
Từ các số liệu phổ 1H - NMR và 13C - NMR, kết hợp với phổ mô phỏng 1H - NMR và so sánh với tài liệu [29] đã xác định đợc cấu tạo của hợp chất B là: axit 3β, 23 - dihydroxy - oleanoic (Hederagenin).
H3C 1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 23 CH3 CH3 COOH 8 OH CH2 CH3 CH3 O H CH3
Kết luận
Tiến hành nghiên cứu đề tài luận văn, chúng tôi đã thu đợc một số kết quả nh sau:
1. Từ vỏ cây vối, sử dụng phơng pháp chiết với dung môi metanol. Cao metanol đợc phân tán vào nớc, sau đó chiết lần lợt với các dung môi: n-hexan, clorofom, etylaxetat, n-butanol. Cao etylaxetat đợc tách bằng phơng pháp sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel, hệ dung môi rửa giải clorofom : metanol tỷ lệ 90:10 đã tách đợc hai hợp chất A và B là đồng phân của nhau.
2. Cấu tạo của các hợp chất A và B đợc xác định bằng các phơng pháp phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR, 13C - NMR, kết hợp với phổ 1H - NMR mô phỏng và so sánh với phổ chuẩn, kết quả cho thấy hợp chất A là: axit 2α ,3
β -dihydroxy -urs -12 -en -28 -oic; hợp chất B là: axit 3β, 23 - dihidroxy -
Danh mục công trình nghiên cứu khoa học
Hoàng Văn Lựu, Trần Thị Thanh, Nguyễn Văn Thanh (2009), Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ vỏ cây vối (Cleistocalyx operculatus
(Roxb) Merr. Et Perry) ở Nghệ An, Tạp chí Hoá học và ứng dụng (đã nhận đăng).
Tài liệu tham khảo
1. Đỗ Huy Bích và những ngời khác (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Xuân Dũng, Đào Hữu Vinh và các cộng sự (1985), Các phơng pháp sắc ký, NXB Khoa học Kỹ thuật.
3. Nguyễn Xuân Dũng, Hoàng Văn Lựu, Tạ Thị Khôi and Piet A. Leclercq (1984), GC and GC/MS Analysis of the leaf oil of Cleistocalyx operculatus (Roxb). Merr et Perry, Journal of Essential Oil Reseach, 6, 661-662.
4. Nguyễn Xuân Dũng, Trần Đình Thắng, Hoàng Văn Lựu, Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu hoa sim, Tạp chí dợc liệu, số 4 -, tập 4, Tr 108 - 109
5. Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Xuân Dũng, Hoàng Văn Lựu (1997), Nghiên cứu thành phần hóa học cây vối ở Nghệ An, Tạp chí hóa hóa học, T 35, số 3, Tr 47 - 51
6. Nguyễn Văn Đậu, Nguyễn thị Thuận, Đỗ Thị Thanh, Phân lập một số hợp chất từ lá cây vối (2007), Tuyển tập công trình hội nghị khoa học và công nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội, Tr 311 - 315
7. Phan Minh Giang, Trần Thị Hà, Nguyễn Hồng Anh, Phan Tống Sơn (2007), Nghiên cứu hóa thực vật cây sim (rhodomyrtus tomentosa (Ait) Hassk. Myrtaceae, Tuyển tập công trình hội nghị khoa học và công nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội, Tr 340 - 345.
8. Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Ngô Văn Quang, Phan Văn Kiên (2007), Axit asiatic phân lập từ cây sắn thuyền (Syzygium resinosum) và có tác dụng lên vi khuẩn Streptoccus mutans, Tạp chí Dợc học số 7.
9. Văn Ngọc Hớng, Nguyễn Xuân Sinh (2003), Isolasion and Identification of two triterpenoids from the leaves of Syzygium resinosum Gagnep. 8th
Eurasia conference on chemical sciences, Ha Noi, october 21 - 24, p.p.355 10. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất
bản Y học.
11. Hoàng Văn Lựu (1996), Nghiên cứu thành phần hóa học một số cây thuộc họ Sim (Myrtaceae) ở Nghệ An, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Hóa học - Trờng ĐHSP Hà Nội.
12. Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Xuân Dũng, Lê Thị Anh Đào (1994), Đặc trng hóa học tinh dầu hoa vối (cleistocalyx operculatus Roxb. Merr et Perry) của Việt Nam, Thông báo khoa học, Đại học s phạm Hà Nội I, (4), 32 - 34.
13. Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Quang Tuệ (2004), Thành phần hóa học của cây gioi, Tạp chí phân tích hóa, lý và sinh học, Tập 9, số 1, tr 20 - 23 14. Nguyễn Đức Minh (1975), Tính kháng khuẩn của cây thuốc Việt Nam,
NXB Y học.
15. Nguyễn Duy Nh (2008), Trị tiêu chảy bằng ổi, Tạp chí Khoa học phổ thông, số 87, tr 14 - 16
16. Nguyễn Văn Thanh (2008), Tách và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ cây vối cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr. Et Perry ở Nghệ An và cây sắn thuyền syzygium resinosum (gagnep) Merr. Et Perry ở Thanh Hóa, Luận văn Thạc sĩ hoá học - trờng Đại học Vinh.
17. Trịnh Thị Thuỷ, Trần Văn Sung (1993 - 1994), Kết quả nghiên cứu hóa học một số cây thuốc Việt Nam, Tuyển tập các báo cáo Khoa học - Viện Hóa học, 213.
19. C. l. Ye, J. W. Liu, D. Z. Wei, Y. H. Lu, F. Quian (2005), Cancer chemother Pharmacol, 55(5), 447 - 452.
20. Corie Djadjo, Michel Delmee, Joelle Quetin - Leclercq, Antimicrobial