3. Đối tợng nghiên cứu
1.2.3.ứng dụng của cây sim
Tại một vài vùng ở Việt nam người ta dùng búp và lá non để sắc uống chữa bệnh tiêu chảy, kiết lỵ hoặc để rửa vết thương, vết loét.
Lá sim có thể dùng để nhuộm đen.
Quả sim dùng để ăn hoặc chế rwợu vang.
Chơng 2
Các PHƯƠNG PHáp nghiên cứu và thực nghiệm 2.1. Phơng pháp nghiên cứu
2.1. 1. Phơng pháp nghiên cứu
Mẫu hoa tươi lấy về phơi nắng cho khô. Sau đó xử lý mẫu bằng cách ngâm chiết với các dung môi thích hợp thu đợc hỗn hợp các chất dùng cho nghiên cứu phần thực nghiệm.
2.1.2. Phơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các chất
- Sử dụng các phơng pháp sắc ký: + Sắc ký lớp mỏng (TLC).
+ Sắc ký cột thờng (CC).
- Các phơng pháp kết tinh phân đoạn.
2.1.3. Phơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc các hợp chất đợc khảo sát nhờ sự kết hợp các phơng pháp phổ: - Phổ tử ngoại (UV).
- Phổ hồng ngoại (IR). - Phổ khối lợng (EI - MS).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều DEPT.
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Thiết bị và phơng pháp phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chấttừ hoa sim từ hoa sim
2.2.1.1. Hóa chất:
- Các dung môi để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (Pure).
+ metanol + n-hexan + etylaxetat + n-butanol.
- Các dung môi dùng cho sắc ký: Sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA): + n-hexan
+ axeton + metanol.
2.2.1.2 Các phơng pháp sắc ký:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC)
- Sắc ký cột thờng (CC) sử dụng silicagel Merck, cỡ hạt 230 - 400 merck (0,040 - 0,06mm).
- Tinh chế các hợp chất.
2.2.1.3. Dụng cụ và thiết bị:
Máy quay cất chân không IKA. Máy đo điểm chảy Kurss optronic. Máy đo phổ tử ngoại UV.
Máy đo phổ hồng ngoại IR. Máy đo phổ khối lợng EI - MS.
Máy đo phổ 1H - NMR Bruker 500MHz. Máy đo phổ 13C - NMR Bruker 125 MHz.
Máy đo phổ cộng hởng từ hạt nhân hai chiều HMBC, HSQC, COSY (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2. Nghiên cứu các hợp chất từ hoa sim2.2.2.1. Phân lập các hợp chất 2.2.2.1. Phân lập các hợp chất
Mẫu hoa sim đợc lấy ở Đông Sơn - Thanh Hoá vào tháng 3/ 2009. Sau khi phơi khô thu đợc 4 kg, ngâm với metanol tinh khiết trong 30 ngày, cất thu hồi dung môi thu đợc cao tổng 400g. Chiết lần lợt với các dung môi n- hexan, cloroform etylaxetat, n- butanol và cất thu hồi dung môi thu đợc các cặn cao tơng ứng:
+ 90g cao n-hexan màu vàng nâu nhạt. + 230g cao etylaxetat màu nâu.
+ 80g cao n-butanol màu nâu đậm.
Các dịch chiết tơng ứng từ hoa sim (Rhodomyrtus tomentosa) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, đã sử dụng phơng pháp sắc ký cột với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chât dùng phơng pháp kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp và thu đợc các chất có độ tinh khiết cao. Để xác định cấu trúc hóa học của các chất thu đợc phải sử dụng các phơng pháp phổ để khảo sát.
Việc phân lập các thành phần hóa học từ hoa sim (Rhodomyrtus tomentosa) đợc thực hiện theo sơ đồ 2.1.
- Ngâm với metanol 3 lần
- Lọc dịch chiết và loại bỏ dung môi
Sơ đồ2.1: Sơ đồ phân lập các chất từ hoa sim
2.2.2.2. Phơng pháp tiến hành sắc ký cột cao etylaxetat
Cao n-hexan đợc trộn theo tỷ lệ thích hợp (1:1) với silicagel (254 Merck) rồi cho vào cột sắc ký đã đợc nhồi bằng pha tĩnh silicagel. Tiến hành sắc ký cột
CAO METANOL
Mẫu khô
Bã mẫu
Phân tán vào nước Chiết với dung môi và cho bay hơi tự nhiên
Cao n-hexan CAO
CLOROFOM ETYLAXETATCAO Dịch chiết butanol hexan clorofom etylaxetat butanol
Hệ dung môi 9:1 Hệ dung môi2:1 Hợp chất A Hợp chất B Hệ dung môi n- hexan: axeton
với các hệ dung môi triển khai theo tỷ lệ thay đổi (bảng 2.1), lấy lần lợt những thể tích xác định dung dịch chảy ra khỏi cột. Cất thu hồi dung môi, dung axeton hoặc metanol để rửa chất thu đợc đọng lại trong bình cầu. Tiếp tục sắc ký với các hệ dung môi cũ hoặc với chất mới tùy thuộc vào sự thay đổi màu sắc chất cất đợc. Các phân đoạn thu đợc của quá trình sắc ký cột cao n-hexan đợc thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Các phân đoạn thu đợc của quá trình sắc ký cột cao n-hexan
Hệ dung môi STT Tỉ lệ Phân đoạn
n- hexan : axeton
1 19:1 MSFE 1→ MSFE 2
2 9:1 MSFE 3→ MSFE 12
3 4:1 MSFE 13→ MSFE 43
4 2:1 MSFE 44 → MSFE 115
100% axeton 5 MSFE 116→ MSFE 140 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
axeton : metanol 6 4:1 MSFE 141→ MSFE 142
Tại hệ dung môi n-hexan: axeton (9:1) thu đợc hợp chất A (sau khi kết tinh lại)
Tại hệ dung môi n-hexan: axeton (2:1) thu đợc hợpchất B (sau khi kết tinh lại)
kết quả và thảo luận 3.1. Xác định cấu trúc của hợp chất A (TDH11)
Từ các số liệu phổ 1H - NMR và 13C - NMR của hợp chất A so sánh với phổ chuẩn đã xác định đợc cấu trúc của hợp chất A là Stigmastan-3,6-dion.
Phổ 1H - NMR của hợp chất A có những tín hiệu cộng hởng đặc trng sau: Tín hiệu cộng hởng của 6 nhóm metyl có các giá trị độ chuyển dịch hoá học tơng ứng nh sau: δ = 0,69ppm (singlet) (3H, H18) 0,95ppm (singlet) (3H, H19) 0,92ppm (doublet) (3H, H21) J=6,5Hz 0,85ppm (doublet) (3H, H26) J=7,5Hz 0,81ppm (doublet) (3H, H27) J=7,0Hz 0,83ppm (doublet) (3H, H29) J=7,0Hz Phổ 13C - NMR của hợp chất A có những tín hiệu cộng hởng đặc trng sau:
Tín hiệu cộng hởng của hai nguyên tử cacbon của hai nhóm xeton (C=O) trong vòng ở vị trí số 3 và số 6 có các giá trị độ chuyển dịch hoá học nh sau:
δ = 211,20ppm (C3) 209,06ppm (C6)
Tín hiệu cộng hởng của 6 nguyên tử cacbon của 6 nhóm metyl có các gtía trị độ chuyển dịch hoá học nh sau:
δ = 12,09ppm (C18) 12,58ppm (C19) 18,73ppm (C21) 19,82ppm (C26) 19,05ppm (C27)
12,04ppm (C29)
Công thức cấu tạo của hợp chất A:
Hợp chất TDH 11 (C29H48O2)
(Stigmastane-3,6-dionne)
Bảng phổ cộng hởng từ của hạt nhân của hợp chất A
TT Nhóm C 13C-NMR δ (ppm) 1H-NMR δ (ppm) 1 -CH2- 38.16 2 -CH2- 37.40 3 -C=O 211.20 4 -CH2- 37.02 5 -CH- 57.57 6 -C=O 209.06 7 -CH2- 44.66 8 -CH- 38.08 9 -CH- 53.56 10 -C- 41.28 11 -CH2- 21.72 12 -CH2- 39.44 13 -C- 43.06 14 -CH- 56.67 15 -CH2- 24.04 1.10, dd, J = 6.5; 13, H-15α 1.54, s, H-15β 16 -CH2- 28.06 17 -CH- 56.08 18 -CH3 12.09 0.69 (s) 19 -CH3 12.58 0.95 (s) 20 -CH- 36.08
21 -CH3 18.73 0.92 (d) J = 6.5 22 -CH2- 33.89 23 -CH2 26.15 24 -CH 45.87 25 -CH 29.22 26 -CH3 19.82 0.85 (d) J = 7.5 27 -CH3 19.05 0.81 (d) J = 7.0 28 -CH2 23.12 29 -CH3 12.04 0.83 (d) J = 7.0
3.2. Xác định cấu trúc của hợp chất B (TDH10)
Từ các số liệu phổ cộng hởng từ hạt nhân của hợp chất B, so sánh với phổ chuẩn đã xác định đợc cấu trúc hợp chất B là β - Sitosterol.
Phổ 1H-NMR của hợp chất B có những tín hiệu cộng hởng đặc trng sau: Proton vinylic (H6) có độ chuyển dịch hoá học δ = 5,34ppm.
Proton H3 của nhóm -CHOH có độ chuyển dịch hoá học δ = 3,52ppm. Các proton của 6 nhóm CH3 có các độ chuyển dịch hoá học
δ = 0,68ppm (singlet) 3H18 1,00ppm (singlet) 3H19 0,92ppm (doublet), J=6,5Hz 3H21 0,81ppm (doublet), J=7,0Hz 3H26 0,83ppm (doublet), J=7,0Hz 3H27 0,85ppm (doublet), 3H29
Phổ 13C-NMR của hợp chất B có những tín hiệu cộng hởng đặc trng sau: Các nguyên tử C của liên kết đôi có các giá trị độ chuyển dịch hoá học:
δ = 140,77ppm C5
121,73ppm C5
Nguyên tử C của nhóm -CHOH (C3) có độ chuyển dịch hoá học δ = 71,83ppm.
Các nguyên tử C của 6 nhóm CH3 có các giá trị độ chuyển dịch hoá học
δ = 11,87ppm C18 19,40ppm C19 18,79ppm C21 19,05ppm C26 19,82ppm C27 11,99ppm C29
Công thức cấu tạo của hợp chất B:
Bảng số liệu cộng hởng từ hạt nhân của hợp chất B (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
TT Nhóm C 13C-NMR δ (ppm) 1H-NMR δ (ppm) 1 -CH2- 37.27 2 -CH2- 31.68 3 -CH- 71.83 3.52 (m) 4 -CH2- 42.32 5 -C= 140.77 6 -CH= 121.73 5.34 (brs) 7 -CH2- 31.93 8 -CH- 31.93 9 -CH- 50.17 10 -C- 36.52 11 -CH2- 21.10 12 -CH2- 39.80 13 -C- 42.32 14 -CH- 56.79 15 -CH2- 24.31 16 -CH2- 28.25 17 -CH- 56.09 18 -CH3 11.87 0.68 (s) 19 -CH3 19.40 1.00 (s) 20 -CH 36.16 21 -CH3 18.79 0.92 (d) J = 6.5 22 -CH2- 33.98 23 -CH2- 26.13 24 -CH 45.87
25 -CH 29.19
26 -CH3 19.05 0.81 (d) J = 7 27 -CH3 19.82 0.83 (d) J = 7 28 -CH2- 23.10
Kết luận
1. Từ hoa sim, chiết với metanol thu đợc cao metanol; cao metanol chiết lần lợt với n-hexan, clorofom, etylaxetat, butanol.
Cao n-hexan của hoa sim bằng phơng pháp sắc ký cột trên silicagel hệ dung môi: n-hexan: axeton với sự tăng dần hàm lợng axeton đã tách đợc hai hợp chất A và B.
2. Đã xác định đợc cấu trúc của hai hợp chất A và B bằng các phơng pháp phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR. So sánh với phổ chuẩn. Kết quả cho biết hợp chất A là Stigmastan-3,6-dion; hợp chất B là β - sitosterol.
Tài liệu tham khảo
Tiếng Việt
1. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tr. 1047- 1048, Nhà xuất bản Y học, thành phố Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Xuân Dũng, Trần Đình Thắng, Hoàng Văn Lựu (1999), Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu hoa sim- Tạp chí dợc liệu, 4 (4)tr. 108, 109.
3. Phan Minh Giang, Trần Thị Hà, Nguyễn Thị Hồng Anh, Phan Tống Sơn (2007), Nghiên cứu Hóa thực vật cây sim (Rhodomyrtus tomentosa Ait. Hassk, Myrtaceae), Hội nghị khoa học và công nghệ Hóa học Hữu cơ toàn quốc lần thứ t, Hà Nội tháng 10/2007, tr. 340-345.
4. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam- Nhà xuất bản Trẻ.
5. Hoàng Văn Lựu (2003), Thành phần hóa học của tinh dầu rễ sim (Rhodomyrtus tomentosa Ait. Hassk) của Việt Nam- Tạp chí Hóa học và ứng dụng, 9, tr. 29-31.
6. Hoàng Văn Lựu (1996 ), Nghiên cứu thành phần hóa học của một số cây thuộc họ Sim (Myrtaceae), và họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) ở Việt Nam- Luận án phó Tiến sĩ Hóa học- Trờng Đại học S phạm Hà Nội.
7. Nguyễn Quang Tuệ, Hoàng Văn Lựu (2004), Thành phần Hóa học của cây gioi- Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, 9 (1), tr. 20-23.
8. Đỗ Thị Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa học của hoa cây sim (Rhodomyrtus tomentosa Wight)- Luận văn tốt nghiệp Đại học- Trờng Đại học Vinh.
9. Trần Đình Lý (Chủ biên) và các cộng sự (1994), 1900 loài cây có ích ở Việt Nam - Nhà xuất bản thế giới, Hà Nội.
10. Phan Tống Sơn và cộng sự (1973), Thành phần hóa học của tinh dầu chổi xuể vùng Quảng Ninh, Việt Nam; Tạp chí Hóa học tr. 4, 39.
11. Nguyễn Thị Thái Hằng (1995), Nghiên cứu tinh dầu một số loài thuộc chi Eucalyptus ở Việt Nam và khả năng sử dụng chúng trong ngành Dợc học, Luận án Tiến sĩ Dợc học- Trờng Đại học Dợc Hà Nội.
Tiếng Anh
12. Nguyễn Xuân Dũng, Lê Thanh and P.A. Leclercq (1996), Volatile constituents of Baeckia frutesceus L. (Myrtaceae) from Viet Nam. Jounal of Essential Oil Research.
13. Dachriyanus, S., Melvyn V. Sargent, Brian W.Skelton, IWang Soediro, Mumu Sutisna, Allan H. White and Elin Yulinah (2002), Rhodomyrtone, from Rhodomyrtus tomentosa an Antibiotic- Aust.j.chem. 55, pp. 229-232 14. Wai-HannHui and Man MoonLi (1975), Triterpenoids and steroids from
Rhodomyrtus tomentosa- Phytochemistry, v. 14, pp. 833 - 834.
15. Wai-HannHui and Man MoonLi (1976), Two new triterpenoids from
Rhodomyrtus tomentosa- Phytochemistry, v. 15, pp. 1741- 1743.
16. Markham K.R, Chari V.M, Marby T.J. (1982), The flavonoids: Advances in Research Chapman and Hall, London
17. Cui B, Nakamura M, Kinjo J, Nohara T (1993), Chem. Pharm. Bull, 41, pp. 178-182.
18. Webby R.F(1991), Phytochemistry, 30, pp. 2443- 2444.
19. Hỹbner G, Wray V, Nahrstedt A(1999), Planta Med, 65, pp. 636-642 . 20. Lowry. J. B (1996) , Phytochemistry , 15, pp. 513- 516. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
21. Zhang Fengxia, Liu Meifang and Lu Renrong (1990), Chemical constituents from the bud of cleis to Calyx operculatus Zhwu xuebao 32 (6), pp. 469.
22. E. Breitmaier and W. Voelter (1986), Carbon- 13 NMR Spectroscopy (VHC, Weiheim), p. 450 (Dimethylsulfoxide).