Phơng pháp phân tích, tách và phân lập các chất- 123docz.net

1. Họ sim

2.2. Phơng pháp phân tích, tách và phân lập các chất

Các phơng pháp sử dụng trong quá trình phân tích, phân tách và phân lập các chất là:

Sắc ký lớp mỏng (TLC).

Sắc ký cột thờng sử dụng silicagen (254 - Merck). Các phơng pháp kết tinh phân đoạn.

2.3. Phơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất:

Cấu trúc của các hợp chất đợc khảo sát nhờ sự kết hợp giữa các phơng pháp phổ:

Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H- NMR. Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C- NMR.

Phổ khối lợng bắn phá dòng electron (EI - MS). Phổ mô phỏng ACD/HNMR; ACD/CNMR.

Phổ khối lợng EI – MS ghi trên thiết bị Engine 5989B – MS, dòng e có năng lợng 70 eV. Phổ 1H – NMR ghi trên thiết bị Brucker Advance tần số 500 MHz và phổ 13C - NMR ghi trên thiết bị Brucker Advance tần số 125 MHz, trong dung môi hỗn hợp CDCl3 – MeOD; ở nhiệt độ 3000K.

Chơng 3 Thực nghiệm

3.1. Dụng cụ, thiết bị và hoá chất.

3.1.1.Dụng cụ, thiết bị.

+ Cột sắc kí thờng (CC) chiều dài 1,4m; đờng kính 4,5cm sử dụng silicagel (254- Merck).

+ Sắc kí bản mỏng (TLC). + Bộ chng cất thờng.

+ Một số vật dụng cần thiết. + Máy đo phổ khối lợng EI-MS.

+ Máy đo phổ 1H-NMR Bruker 500 MHz. + Máy đo phổ 13C-NMR Bruker 125 MHz.

+ Máy đo phổ cộng hởng từ hạt nhân một chiều DEPT. + Máy đo phổ hồng ngoại IR.

3.1.2. Hoá chất .

- Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật nghiên cứu đều dùng loại tinh khiết (pure).

+ Axeton: CH3- CO- CH3 + Metanol: CH3OH + Clorofom: CHCl3 + Etylaxetat: CH3COOC2H5 + n-Hexan: n- C6H14 + Nớc cất: H2O + Iốt: I2 + Silicagel.

- Dung môi dùng cho các loại sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Dung môi đợc dùng: n-Hexan, metanol, clorofom, axeton, etyl axetat

3.2. Thực nghiệm:

3.2.1. Thu hái mẫu:

Vỏ vối đợc thu hái ở phờng Lê Mao, thành phố Vinh, tỉnh Nghệ An, vào đầu tháng 2 năm 2008 đợc 43kg mẫu tơi. Mẫu sau khi lấy về đợc rửa sạch, chặt nhỏ sau đó ngâm qua etanol 960 rồi phơi trong bóng râm cho đến khô, cân đợc 27kg.

3.2.2. Ngâm các hợp chất từ vỏ cây vối và tách các chất bằng phơng pháp sắc ký cột:

Sau đó mẫu đợc ngâm trong metanol trong khoảng thời gian 90 ngày rồi lọc tách và cho bay hơi tự nhiên cho đến khô thu đợc cao metanol (0,7kg). Cao metanol đợc phân tán với nớc cất rồi chiết lần lợt với các dung môi n-hexan, etylaxetat, clorofom, butanol, cũng cho bay hơi tự nhiên thu đợc các cao tơng ứng. Cao clorofom (0,3kg) đợc trộn đều với silicagel theo tỉ lệ 1:1 rồi đợc nhồi vào cột sắc kí với pha tĩnh là silicagel (Merck) cỡ hạt 0,040- 0,063 mm (254 – Merck). Tiến hành sắc ký với hệ dung môi rửa giải là clorofom- metanol với tỉ lệ tăng dần độ phân cực, lấy lần lợt các thể tích xác định chảy ra khỏi cột, cất thu hồi dung môi một phần rồi cho bay hơi tự nhiên thu đợc các phân đoạn tơng ứng.

Sau khi cho dung môi vào rửa giải thấy trên cột xuất hiện ba khoảng màu. Dới cùng có màu vàng đậm, ở giữa có màu xanh đen, tiếp đến có màu vàng nhạt, trên cùng có màu đen

3.2.3. Tách - kết tinh lại thu đợc các chất rắn:

Tại phân đoạn 70 tơng ứng với hệ dung môi 90:10 xuất hiện một chất rắn màu vàng nhạt với một lợng lớn. Thử hoà tan trong n-hexan thấy ít tan trong n- hexan nên n-hexan đợc dùng để rửa chất bẩn nhiều lần. Sau khi đợc rửa nhiều lần với n-hexan, chất rắn đợc thử hoà tan trong axeton thì thấy tan rất ít trong axeton lạnh nhng tan gần hết trong axeton nóng nên axeton đợc dùng làm dung môi kết tinh và thu đợc một chất rắn màu trắng kí hiệu là hợp chất TDVV 7.

Hợp chất này khi thử trên bản mỏng thấy hiện lên 2 vết nên có khả năng là hỗn hợp đồng phân của 2 chất.

Ngâm trong metanol 90 ngày

Lọc dịch chiết và cho bay hơi tự nhiên

Phân tán vào nớc

Chiết với các dung môi và cho bay hơi tự nhiên n - hexan clorofom etylaxetat butanol

Nhồi cột

Rửa giải bằng dung môi clorofom - metanol

Sơ đồ tách các hợp chất từ vỏ cây vối

3.2.4 . Xác định cấu trúc.

Xác định cấu trúc các chất bằng các phơng pháp phổ.

Mẫu khô (27 kg)

Bã mẫu Cao metanol

Cao n-hexan Cao clorofom Cao etylaxetat t Dịch chiết butanol Hệ dung môi 90:10 Hợp chất TDVV 7

Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H- NMR. Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C- NMR.

Phổ khối lợng bắn phá dòng electron (EI - MS). Phổ cộng hởng từ hạt nhân một chiều DEPT

Chơng 4

Kết quả và thảo luận

4.1. Xác định cấu trúc hợp chất trong mẫu TDVV7:

Hợp chất TDVV 7 có dạng vô định hình màu trắng: . Hợp chất này khi thử trên bản mỏng thấy hiện lên 2 vết nên có khả năng là hỗn hợp đồng phân của 2 chất.

Cấu trúc của hợp chất TDVV7 đợc xác định bằng các phơng pháp phổ:

4.1.1. Xác định cấu trúc hợp chất 1 trong mẫu TDVV7: - Phổ khối lợng ( EI MS )– - Phổ khối lợng ( EI MS )–

Phổ khối lợng đợc ghi bằng phơng pháp đa mẫu vào trực tiếp bắn phá

bằng dòng electron (EI) năng lợng 70 eV.

Phổ khối lợng: cho pic phân tử có M+ = 456 .Trong khối phổ của hợp chất 1 ngoài ra còn có các đỉnh của các mảnh khác có m/e = 248, 203, 69, 57…

(Hình1)

C16H24O2+ −COOH→ C15H23+ có số khối 203 −C H5 10 → C10H13+ (133) C H2 4 − → C8H9+ (105) C4H9+ có số khối 57. C4H7+ có số khối 55. C5H9+có số khối 69. - Phổ cộng hởng từ hạt nhân1H NMR– .

Phổ 1H – NMR có phổ đồ nh hình 3 với những tín hiệu đặc trng sau

δ = 5,172 ppm (triplet) là tín hiệu của proton của nhóm - CH = (ở vị trí C12), hằng số tơng tác spin - spin J = 3,5 Hz.

Với δ = 3,269 ppm (doublet) là tín hiệu của proton nhóm - CH - OH (ở vị trí C3).

Ngoài ra còn có tín hiệu cộng hởng của 7 pic đơn (singlet) của 7 nhóm - CH3 có các giá trị δ = 1,159 ppm; 0,990 ppm; 0,880 ppm; 0,880 ppm; 0,852 ppm; 0,825 ppm; 0,717 ppm (là tín hiệu của các nguyên tử lần lợt C27, C23, C29, C30, C24, C25, C26). Có phổ đồ nh hình 5.

- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C- NMR.

Phổ 13C - NMR của hợp chất 1 trong mẫu TDVV7: có các phổ đồ nh (Hình 8 và hình 6) Hợp chất 1 gồm: 8 C + + 5 CH + 10 CH2 7 CH3 +

Cũng dễ nhận thấy một số pic đặc trng trên phổ 13C - NMR của hợp chất 1 sau:

- Pic – CH - với độ chuyển dịch hoá học δ = 78,707 ppm là pic - CH - OH (cờng độ cao hơn so với pic - CH - khác). ở vị trí C3.

- Pic - CH - với δ = 122,131 ppm là tín hiệu của - CH = (ở vị trí C12).

- Pic – C - với δ = 181,000 ppm là tín hiệu của C nhóm cacbonyl (- C = O) của axit (ở vị trí C28).

Trong trờng hợp này là tín hiệu của axit. Nh vậy khi xét các pic đặc trng phổ 13C - NMR có thể thấy phân tử hợp chất 1 trong TDVV7 có 3 nguyên tử O.

Tổng hợp số liệu từ phổ 1H và 13C từ thực nghiệm so với chất chuẩn.

Bảng 18: Số liệu cộng hởng từ hạt nhân của hợp chất 1 mẫu TDVV7. Số C Nhóm C (δ)13C - NMR (ppm) (δ) 1H - NMR (ppm), J (Hz) 1 CH2 38.545 2 CH2 26.692 3 CH - OH 78.707 3.269 (m) 4 C 39.124 5 CH 55.140 6 CH2 18.171 7 CH2 32.419 8 C 39.347 9 CH 47.687 10 C 36.864 11 CH2 22.910 12 CH 122.131 5.172 (t); J1 = J2 = 3.5 13 C 143.763 14 C 41. 942

15 CH2 27.540 16 CH2 23.120 17 C 46.482 18 CH 41.260 19 CH2 45.864 20 C 30.487 21 CH2 33.744 22 CH2 32.617 23 CH3 27.860 0.990 (s) 24 CH3 15.397 0.852 (s) 25 CH3 15.211 0.825 (s) 26 CH3 16.796 0.717 (s) 27 CH3 25.663 1.159 (s) 28 C = O 181.000 29 CH3 32.847 0.880 (s) 30 CH3 23.331 0.880 (s)

Từ các số liệu phổ khối lợng, phổ 1H – NMR, phổ 13C - NMR, phổ DEPT, của hợp chất 1 cho thấy có sự phù hợp hoàn toàn giữa số liệu thực nghiệm với số liệu mẫu chuẩn

Kết luận: Mẫu TDVV7 có công thức phân tử C30H48O3 là axit oleanolic. CTCT: O H C H3 CH3 CH3 CH3 CH3 C H3 CH3 O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 (II)

4.1.2. Xác định cấu trúc hợp chất 2 trong mẫu TDVV7:

- Phổ khối lợng (EI MS)–

Phổ khối lợng đợc ghi bằng phơng pháp đa mẫu vào trực tiếp bắn phá bằng

dòng electron (EI) năng lợng 70 eV.

Phổ khối lợng: cho pic phân tử có M+ = 456. Trong khối phổ của hợp chất 2 ngoài ra còn có các đỉnh của các mảnh khác có m/e = 248, 203, 69, 57…

(Hình1)

Mảnh 248 có cờng độ cao (100%) do sự phân cắt ion phân tử theo cơ chế phản ứng Retro Diels - Alder phân cắt liên kết giữa C9 và C11 và liên kết giữa C8 và C14. Các mảnh cờng độ lớn có các số khối m/e = 248 (100%), 203, 133, 105, 69, 55. HO COOH COOH C16H24O+2 + + M+ = 456 (m/e = 248) -C14H24O C16H24O2+ −COOH→ C15H23+ có số khối 203 −C H5 10 → C10H13+ (133) C H2 4 − → C8H9+ (105) C4H9+ có số khối 57. C4H7+ có số khối 55. C5H9+có số khối 69.

- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H NMR– .

Phổ 1H – NMR có phổ đồ nh hình 3 với những tín hiệu đặc trng sau

δ = 5,141 ppm (triplet) là tín hiệu của proton của nhóm - CH = (ở vị trí C12), hằng số tơng tác spin - spin J = 3,5 Hz.

Với δ = 3,094 ppm, j1 = j2=7,5 Hz(doublet) là tín hiệu của proton nhóm - CH - OH (ở vị trí C3).

Ngoài ra còn có tín hiệu cộng hởng của 7 pic đơn (singlet) của 7 nhóm - CH3 có các giá trị δ = 1,043 ppm; 0,990 ppm; 0,880 ppm; 0,807 ppm; 0,762 ppm; 0,688 ppm; 0,675 ppm (là tín hiệu của các nguyên tử lần lợt C27, C26, C23, C30, C29, C25, C24). Có phổ đồ nh hình 5.

- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C- NMR.

Phổ 13C - NMR của hợp chất 2 trong mẫu TDVV7: có các phổ đồ nh (Hình 8 và hình 6) Hợp chất 2 gồm: 8 C + + 5 CH + 10 CH2 + 7 CH3

Cũng dễ nhận thấy một số pic đặc trng trên phổ 13C - NMR của hợp chất 2 sau:

- Pic – CH - với độ chuyển dịch hoá học δ = 76.793 ppm là pic - CH - OH (cờng độ cao hơn so với pic - CH - khác). ở vị trí C3.

- Pic - CH - với δ = 125,361 ppm là tín hiệu của - CH = (ở vị trí C12).

- Pic – C - với δ = 178,000 ppm là tín hiệu của C nhóm cacbonyl (- C = O) của axit (ở vị trí C28).

Trong trờng hợp này là tín hiệu của axit. Nh vậy khi xét các pic đặc trng phổ 13C - NMR có thể thấy phân tử hợp chất 2 trong TDVV7 có 3 nguyên tử O.

Tổng hợp số liệu từ phổ 1H và 13C từ thực nghiệm so với chất chuẩn.

Bảng 19: Số liệu cộng hởng từ hạt nhân của hợp chất 2 mẫu TDVV7.

Số C Nhóm C (δ)13C - NMR (ppm) (δ) 1H - NMR (ppm), J (Hz) 1 CH2 38.324 2 CH2 26.938 3 CH - OH 76.793 3,094(m) j1=j2=7,5 4 C 38.834 5 CH 54.743 6 CH2 17.950 7 CH2 32.662 8 C 41.270 9 CH 46.977 10 C 36.479 11 CH2 22.797 12 CH 125.361 5.141 (t); J1 = J2 = 3.5 13 C 138.076 14 C 41.601 15 CH2 27.540 16 CH2 24.080 17 C 46.273 18 CH 52.726 19 CH2 38.956 20 C 38.772 21 CH2 30.535 22 CH2 36.797 23 CH3 27.826 0,880 (s) 24 CH3 15.211 0,675 (s) 25 CH3 16.647 0,688 (s) 26 CH3 16.796 0,990 (s) 27 CH3 23.331 1,043 (s) 28 C = O 178.000 29 CH3 16.715 0,762 (s) 30 CH3 20.922 0,807 (s)

Từ các số liệu phổ khối lợng, phổ 1H – NMR, phổ 13C - NMR, phổ DEPT, của hợp chất 2 cho thấy có sự phù hợp hoàn toàn giữa số liệu thực nghiệm với số liệu mẫu chuẩn

Kết luận: Mẫu TDVV7 có công thức phân tử C30H48O3 là axit ursolic. CTCT:

Kết luận

Tiến hành nghiên cứu thành phần hoá học của vỏ cây vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb). Merr Et Perry) mẫu lấy ở thành phố Vinh, tỉnh Nghệ An, chúng tôi đã thu đợc một số kết quả sau:

1. Bằng phơng pháp ngâm chiết với dung môi Metanol, cao metanol đợc chiết lần lợt với n-hexan, etylaxetat, clorofom, cao clorofom, sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel, hệ dung môi rửa giải là clorofom : metanol với độ phân cực tăng dần lần lợt thu đợc các phân đoạn khác nhau. Tiến hành rửa và kết tinh nhiều lần, đã thu đợc một số hợp chất tơng đối sạch trong đó có hợp chất TDVV7 là hỗn hợp 2 chất từ vỏ cây vối.

2. Sử dụng kết hợp các phơng pháp phổ khối lợng (MS), phổ cộng hởng từ hạt nhân một chiều (1H - NMR, 13C - NMR, DEPT), hai chiều (HMBC, HSQC) đã xác định đợc cấu trúc của hợp chất TDVV 7 là:

Hợp chất 1: axit oleanolic. (dẫn xuất tritecpenoit năm vòng) Hợp chất 2: axit ursolic. (dẫn xuất tritecpenoit năm vòng)

Tài liệu tham khảo

1. Viện dợc liệu (2005). Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam.

2. Đỗ Tất Lợi (2005). Những cây thuốc và vị thuốc ViệtNam. Nhà xuất bản y học. 3. Hoàng Văn Lựu (1996) Nghiên cứu thành phần hoá học một số cây thuộc họ Sim

(Myrtaceae) ở Nghệ An.Luận án phó tiến sĩ khoa học hoá học - ĐHQGHN, Tr- ờng ĐHSP Hà Nội.

4. Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Xuân Dũng, Lê Thị Anh Đào (1994). Đặc trng hoá học tinh dầu hoa vối (Cleistocalyx operculatus Roxb. Merr et Perry) của Việt Nam.

Thông báo khoa học, Đại học s phạm Hà Nội I, (4), 32 – 3 5. Hoàng Thị Sản (2001). Phân loại thực vật học. NXB Giáo dục.

6. Nguyễn Quang Tuệ (1999) - Nghiên cứu thành phần hóa học của thành phần cây Gioi - Luận văn thạc sĩ khoa học Hóa Học. ĐHSP Vinh

7. Vũ Văn Chuyên , Lê Trần Chấn, Trần Hợp (1987) -Địa lý các họ cây Việt Nam. NXB Khoa học kỹ thuật .

8. Võ Văn Chi, Trần Hợp (1999) - Cây có ích ở Việt Nam, Tập 1 - NXB GD 9. Võ Văn Chi và Vũ Văn Chuyên(1974). Cây cỏ thờng thấy ở Việt Nam. Tập 4.NXB Khoa học và Kỹ thuật.

10. Nguyễn Xuân Dũng, P. A. Leclercq, Leo M. Van de Ven, Nguyễn Thị Diễm Trang, Lê Văn Hạc, Hoàng Văn Lựu và các cộng sự (11/1994). Một số ứng dụng của phơng pháp cộng hởng từ hạt nhân (NMR) trong nghiên cứu hoá học các hợp chất thiên nhiên. Hội thảo “Phơng pháp cộng hởng từ hạt nhân phân giải cao đối với sự phát triển khoa học và công nghiệp ở Việt Nam". Viện Hoá