CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Cỏc phương phỏp nghiờn cứu
2.2.1.Thiết bị và hoỏ chất
2.2.1.1. Thiết bị
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H – NMR được đo trờn mỏy Bruker 500MHz, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC được đo trờn mỏy Bruker 125MHz
2.2.1.2. Hoỏ chất
Cỏc dung mụi để ngõm chiết mẫu thực vật đều dựng loại tinh khiết (pure) + Axeton
+ Butanol + Cloroform + Etylaxetat
Cỏc dung mụi dựng cho sắc ký cột và sắc kớ lớp mỏng sử dụng loại tinh khiết phõn tớch (PA) + Hexan + Nước cất + Iốt + Silicagel cỡ hạt 0,040- 0,063mm (254Merck). 2.2.2. Tỏch và xỏc định cấu trỳc hợp chất
* Thu hỏi mẫu
Mẫu hoa sim được lấy ở huyện Triệu Sơn – tỉnh Thanh Hoỏ vào thỏng 3/ 2010. Sau khi lấy về rửa sạch, nhỳng qua cồn 96 0, nghiền nhỏ, phơi khụ được 5 kg.
* Chiết và tỏch cỏc hợp chất từ hoa sim
Sau khi tiến hành phơi khụ mẫu, xử lý mẫu bằng cỏch ngõm với metanol tinh khiết trong 15 ngày. Lọc dịch chiết và chưng cất loại bỏ dung mụi ở ỏp suất thấp thu được 40g cao metanol.
Lấy một phần cao metanol hoà tan trong nước cất, sau đú lần lượt chiết với cỏc dung mụi hexan, clorofom, etylaxetat, butanol và loại bỏ dung mụi được cỏc cao hexan, cao clorofom, cao etylaxetat, phần dịch chiết butanol và phần cặn.
Cao clorofom trộn đều với silicagen theo tỉ lệ 1:1 rồi cho vào cột sắc ký đó được nhồi bằng pha tĩnh silicagel cỡ hạt 0,040 - 0,063mm (254 - Merck). Tiến hành sắc kớ với hệ dung mụi rửa giải là CH2Cl2 : CH3OH với tỉ lệ tăng dần độ phõn cực thu được cỏc phõn đoạn (mỗi phõn đoạn 80ml), sau đú cất thu hồi dung mụi được cỏc phõn đoạn tương ứng ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Số liệu quỏ trỡnh chạy cột cao clorofom hoa sim
STT Hệ dung mụi CH2Cl2/ MeOH Tỉ lệ Phõn đoạn
2 CH2Cl2/ MeOH 98:2 11:30 3 CH2Cl2/ MeOH 95:5 31:40 4 CH2Cl2/ MeOH 90:10 41:60 5 CH2Cl2/ MeOH 85:15 61:80 6 CH2Cl2/ MeOH 80:20 81:100 7 CH2Cl2/ MeOH 75:25 101:110 8 CH2Cl2/ MeOH 70:30 111:125 9 CH2Cl2/ MeOH 65:35 126:160 10 CH2Cl2/ MeOH 60:40 161:170 11 CH2Cl2/ MeOH 50:50 171:180 12 CH2Cl2/ MeOH 40:60 181:185 13 CH2Cl2/ MeOH 30:70 186:190
Phõn đoạn 100 ứng với hệ dung mụi 90 : 10 xuất hiện một chất rắn màu trắng. Dựng n – hexan và axeton kết tinh nhưng khụng tan trong hai dung mụi này nờn hai dung mụi này được dựng để rửa giải nhiều lần. Thử kết tinh trong hệ dung mụi CH2Cl2/MeOH 4 : 2 thấy tan trong hệ dung mụi này nờn được dựng làm dung mụi kết tinh nhiều lần thu được tinh thể sạch hỡnh kim kớ hiệu là chất A.
Cao etylaxetat được tiến hành sắc kớ cột với chất rửa giải là hệ dung mụi CHCl3 : MeOH với độ phõn cực tăng dần của dung mụi thu đựơc cỏc phõn đoạn khỏc nhau tương ứng ở bảng 2.2.
Bảng 2.2: Số liệu quỏ trỡnh chạy cột cao etylaxetat hoa sim
STT Hệ dung mụi CHCl3/MeOH Tỉ lệ
1 CHCl3/MeOH 10: 0 2 CHCl3/MeOH 9: 1 3 CHCl3/MeOH 8: 2 4 CHCl3/MeOH 7: 3 5 CHCl3/MeOH 6: 4 6 CHCl3/MeOH 5: 5 7 CHCl3/MeOH 0: 10
Gomcỏc chất thuộc cựng một hệ dung mụi lại rồi tiến hành loại bỏ dung mụi thu được một số chất rắn khụ. Tại tỉ lệ dung mụi 9 : 1 chỳng tụi tiến hành sắc ký cột nhắc lại với cỏc hệ dung mụi tăng dần thu được 6 phõn đoạn nhỏ. Tại phõn đoạn 5 cú một chất rắn màu vàng xanh. Dựng axeton kết hợp rửa và kết tinh nhiều lần thu được một chất bột sạch màu trắng kớ hiệu là chất B.
Việc phõn lập cỏc thành phần húa học từ hoa sim (Rhodomyrtus tomentosa) được thực hiện theo sơ đồ 2.1.
Ngõm trong metanol 3 lần
Lọc dịch chiết và loại bỏ dung mụi
Phõn tỏn vào nước
Chiết với cỏc dung mụi
n-hexan clorofom etyl axetat butanol
Nhồi cột Nhồi cột
Rửa giải bằng dm Rửa giải bằng dm CH2Cl2 – MeOH CHCl3 - MeOH (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tỏch cỏc hợp chất từ hoa cõy sim Mẫu khô
Bã mẫu Cao
metanol
Cao
n-hexan Dịch chiết butanol
Hệ dung môi 90 - 10 Phân đoạn 5 Cao Etyl axetat CAO CLOROFOM Hợp chất B Hợp chất A
Chương 3