1 3 Đặc điểm thực vật
2.1.2 Phơng pháp thu tinh dầu và phân lập các chất
* Lá cây bởi bung thu hái đợc rửa sạch, cắt nhỏ rồi cho vào nồi dung tích 5 (lít). Cất tinh dầu bằng phơng pháp lôi cuốn hơi nớc nh (hình 2.2) nh phần thực nghiệm. Thời gian thu tinh dầu từ 2h-3h, khi đun thêm 15 phút thấy thể tích tinh dầu không tăng thêm thì thôi.
* Hàm lợng tinh dầu đợc tính bằng tỷ lệ % theo thể tích tinh dầu (ml) trên trọng lợng mẫu tơi (gam).
V*100 Trong đó: V- Thể tích tinh dầu ml X%= m- khối lợng nguyên liệu tơi gam m X%- phần trăm tinh dầu
Thu tinh dầu rồi làm khô bằng Na2SO4 khan, bảo quản trong lọ tiêu chuẩn ở nhiệt độ từ 0- 50c cho đến khi phân tích bằng GC-MS.
2.1.3. Phân lập các hợp chất từ thân cây bởi bung
Với cao metanol phần thân cây bởi bung dùng sắc kí cột với hệ dung môi n-hexan: axeton và clorofom: metanol: nớc thoe tỷ lệ phân cực tăng dần
Để làm sạch các chất, ta hòa tan và kết tinh lại nhiều lần với các dung môi metanol và axeton có tỷ lệ khác nhau.
2.1.4 phơng pháp xác định và khảo sát cấu trúc các hợp chất * Sắc kí khí- Khối phổ liên hợp (GC- MS)
* Phổ khối lợng EI-MS (Positive).
* Phổ cộng hởng từ hạt nhân proton 1H-NMR. * Phổ cộng hởng từ hạt nhân cacbon 13C-NMR
* Phổ cộng hởng từ hạt nhân hai chiều HMBC * Phổ cộng hởng từ hạt nhân hai chiều HMQC.
2.2. Tiến hành thực nghiệm 2.2.1 Hoá chất và thiết bị 2.2.1 Hoá chất và thiết bị 2.2.1.1 Hóa chất
Các dung môi để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA).
* Axeton * Axit sunfuric * Cloroform. * n-hexan * Metanol
2.2.1.2 Dụng cụ và thiết bị máy móc
* Sử dụng bộ dụng cụ chng cất tinh dầu nh sau:
Hinh 2.2: Bộ dụng cụ chng cất tinh dầu lá cây bởi bung ống sinh hàn thẳng
Nồi áp suất
ống sừng bò
Bình florentin
2.2.1.3 Thiết bị máy móc
Thành phần hoá học tinh dầu lá bởi bung đợc xác định bằng phơng pháp sắc kí khí (GC) và sắc kí khí- khối phổ liên hợp (GC/MS)
+Sắc kí khí (GC): Agilent Technology (Hewlett-Packard) 6890N, cột HP- 5MS (dài 30m; đờng kính trong 0,25mm; lớp phim dày 0,39 àm). Khí mang: N2. Detector: FID. Chơng trình nhiệt độ: 60oC (2min), tăng 40C/min, cho đến 2000C (10min). Nhiệt độ injector: 2700C. Nhiệt độ detector: 300oC.
+Sắc kí khí- khối phổ liên hợp (GC/MS): Agilent Technology (Hewlett- Packard) HP 6890N, cột HP-5MS (dài 30m; đờng kính trong 0,25mm; lớp phim dày 0,39 àm), liên hợp với khối phổ ký HP 5973N. Khí mang: He. Th viện phổ: NIST (1998), Wiley và Flavor.
2.2.2 Cách tiến hành chng cất thu hồi tinh dầu lá bởi bung
Cho 2,5 kg nguyên liệu tơi và 2,5 lít nớc cất vào nồi áp suất, dùng vĩ ngăn cách để cho nguyên liệu không tiếp xúc với đáy nồi. Vặn nắp nồi đủ kín, dùng bếp điện đun cho hơi nớc và tinh dầu bay hơi sang bộ phận làm lạnh ngng lại chảy xuống bình định mức nh (hình 2.2). Tinh dầu nhẹ hơn nớc nên nổi lên trên, dùng bơm tiêm lấy hết tinh dầu, cho vào lọ và dùng natri sunfat khan làm khô, sau đó cho vào lọ đựng tiêu chuẩn, bảo quản trong tủ lạnh từ 0oc- 50c sau đó đa đi phân tích.
2.2.4 Nghiên cứu chiết và tách một số hợp chất từ thân cây bởi bung
Mẫu cây bởi bung đợc thu hái ở Thanh Chơng Nghệ An vào tháng 3/2008, đựơc PGS.TS. Ngô Trực Nhã, bộ môn thực vật khoa Sinh, Đại học Vinh xác định tên khoa học là: Glycosmis pentaphylla Corr.
Mẫu thân cây sau khi phơi khô và xay nhỏ thu đợc: 10 kg ngâm chiết với metanol (30 ngày). Cất thu hồi dung môi thu đợc cao tổng metanol: 350g
các dịch chiết tơng ứng của cây bởi bung (Glycosmis pentaphylla Corr.)
đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau.
* Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, đã sử dụng phơng pháp sắc ký cột với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thờng phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thờng dùng phơng pháp kết tinh lại trong dung môi thích hợp hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ đó sẽ thu đợc các chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất lý hoá và quang phổ của chúng.
Việc phân lập các thành phần hoá học từ phần thân mặt cây bởi bung (Glycosmis pentaphylla Corr.) đợc thực hiện theo sơ đồ 1
- Chiết với metanol
- Cất loại dung môi SKC clorofom: metanol: nớc 19:1: 0,05 A
Sơ đồ 1: Quy trình ngâm, chiết, tách một số hợp chất từ thân cây bởi bung
Cao metanol Mẫu thân khô xay
2.2.4.1. Cách tiến hành chạy cột cao metanol của cây bởi bung
Sau khi lắp cột sắc kí nh (hình 2.3), tiến hành nhồi cột nh sau: cho một ít bông phía đáy cột lấy que thép nhồi xuống, sau đó nhồi silicagel (254-Merck) cỡ hạt 0,040- 0,063 mm, theo phơng pháp khô, đổ silicage khoảng 3/5 cột rồi dùng khăn vổ đều quanh cột cho silicagel xuống đều và kín không đợc nhồi quá lỏng cũng nh quá chặt, tiếp đó cho cao đã đợc trộn silicagel theo tỷ lệ thích hợp vào phía trên và cho thêm một ít silicagel và lớp bông ở trên cùng. Tiến hành sắc kí với các hệ dung môi triển khai theo tỷ lệ thay đổi độ phân cực tăng dần (bảng 5), lấy lần lợt những thể tích xác định dung dịch chảy ra khỏi cột. Cất thu hồi dung môi, dùng axeton hoặc metanol để rửa chất thu đợc còn đọng lại trong bình cầu. Tiếp tục sắc kí với các hệ dung môi cũ trong hệ đang chạy cột sau khi cất thu hồi lại dung môi đổ lại tiếp vào cột hoặc hệ dung môi mới ở hệ tiếp theo (bảng 5) tuỳ vào sự thay đổi màu sắc dung dịch chất cất đợc hoặc dựa vào quá trình thử bản mỏng.
Hình 2.3: Cột chạy sắc kí
Bảng 5. Số liệu của quá trình chạy sắc kí cột cao thân cây bởi bung
STT Hệ dung môi Tỷ lệ Phân đoạn
1 n-C6H14 100% PBA 1→ PBA12
2 n-C6H14/axeton 49:1 PBB 13→ PBB 25
3 n-C6H14/axeton 30:1 PBC26→PBC35
4 n-C6H14/axeton 19:1 PBD36→ PBD47
5 n-C6H14/ axeton 9: 1 PBE48→PBE59
6 CHCl3/CH3OH/H2O 40:1:0,05 PBBA60→ PBBA79 7 CHCl3/CH3OH/H2O 30: 1: 0,05 PBBB 80→ PBB86 8 CHCl3/CH3OH/H2O 19: 1: 0,05 PBBC87→PBC100 9 CHCl3/CH3OH/H2O 9: 1: 0,05 PBBD101→PBD125 10 CHCl3/CH3OH/H2O 4: 1: 0,05 PBBE126→ PBBE186 11 CHCl3/CH3OH/H2O 4:2:0,05 PBBL187→ PBBL206
Khi chạy sắc kí cột với hệ dung môi theo thứ tự nh (bảng 5) thì thấy có sự thay đổi màu trên cột sắc kí : Lớp trên cùng có màu vàng nhạt, lớp thứ hai có màu đỏ nhạt, lớp thứ ba có màu tím đậm và lớp cuối cùng có màu đen rồi nhạt dần.
* Sau khi tến hành sắc kí cột cao thân thu đợc các phân đoạn từ pba1 đến pbBL206. tiến hành sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi nh (bảng 6).
* Hệ dung môi rửa giải là CHCl3: CH3OH: H2O = 19: 1: 0,05 thu đợc 14 phân đoạn, từ phân đoạn 87-97 kết tinh đợc một chất gọi là: A.
Bảng 6. Số liệu của quá trình sắc kí bản mỏng các phân đoạn của cao metanol phần thân cây bởi bung.
STT Hệ dung môi Tỷ lệ Phân đoạn 1 n-C6H14/axeton 98:1 PBA 1→ PBA12 2 n-C6H14/axeton 40:1 PBB 13→ PBB 25 3 n-C6H14/axeton 19:1 PBD26→ PBD47 4 CHCl3/CH3OH/H2O 40: 1: 0,05 PBBA48→ PBBA59 5 CHCl3/CH3OH/H2O 30: 1: 0,05 PBB60→ PBB80 6 CHCl3/CH3OH/H2O 19: 1: 0,05 PBBC81→ PBBC112 7 CHCl3/CH3OH/H2O 10: 1: 0,05 PBBD113→ PBBD139 8 CHCl3/CH3OH/H2O 5: 1: 0,05 PBBE140→ PBBL205
Chơng 3: kết quả và thảo luận
3.1. Thành phần hóa học của cây bởi bung (Glycosmis pentaphyllaCorr.)
3.1.1. Kết quả xác định thành phần hóa học và hàm lợng % tinh dầu lá cây bởi bung
Bằng phơng pháp cất lôi cuốn hơi nớc, chúng tôi đã cất đợc tinh dầu của lá cây bởi bung có hàm lợng 0,45% (so với mẫu tơi) nh bảng 7. Tinh dầu bởi bung thu đợc có màu vàng nhạt mùi thơm hắc.
Bảng 7 : Kết quả tách tinh dầu cây bởi bung
Mẫu số 1 2 Khối lợng (kg) 2,5 2,5 Thời gian (phút) 150 180 Thể tích (ml) 11 11,25 Hàm lợng (%) 0,44 0,45
Kết quả từ phân tích GC-MS (hình 3.1) đợc trình bày ở bảng 8.
Bảng 8: Thành phần hóa học và tỷ lệ % các hợp chất trong tinh dầu lá cây bởi bung. TT Tên chất Tỷ lệ % 1 β- Pinen 0,67 2 dl- Limonen 0,05 3 β- Oximen 0,22 4 Linalol 0,09 5 Perilen 0,07 6 Xyclohexasiloxan 0,24 7 1,8-iridadien 0,60 8 α- Cubeben 0,52 9 α- Copaen 2,39 10 β- Elemen 11,73 11 iso- caryophylen 0,34 12 β- Caryophylen 43,11 13 α- Tecpinolen 0.06 14 Becgamoten 0.10
15 β- Selinen 5,33 16 Aromadendren 0,65 17 α- Amopheren 0,56 18 Gemaren- D 0,26 19 (+ -)- Lepidozen 1,74 20 β- Bisabolen 12,62 21 α- Amophen 0,10 22 δ- Cadinen 1,64 23 α- Calacoren 0,04 24 Caryophylen oxit 3,03 25 Nerolidol 0,34 26 β-Spathulennol 0,52 27 δ- Gujunen 0,09 28 Guaiol 0,18 29 γ- Cadinen 0,44 30 α- Bisabolen epoxit 0.30 31 α- Ylangen 0,20 32 Aromadendren 0,30 33 Allo-aromadendren 0,39 34 Adamantan 0,30 35 δ- Cadinen 0,37 36 γ-Muurolen 0,16 37 β- Eudesmol 0,37 38 α- Eudemol 0,70 39 Agathadiol 0,43
40 Dẫn xuất của azulen 0,16
41 Caryophylen oxit 0,16
42 Lanceol 0,20
43 2- (5,- nitro-3,- thietyl) pyrimidin 0,11
44 Camphen 0,08
45 Axit phenylaxetic 0,23
46 Axetat farnesyl- 2 0,18
47 Phytol 4,10
48 Các chất cha xác định 5,43
Từ kết quả phân tích GC-MS cho thấy trong lá cây bởi bung có tới hơn 47 hợp chất, trong đó 47 hợp chất đã đợc xác định, thành phần chính là: β- caryophylen (43,11%), β-bisabolen (12,62%) và β- elemen (11,73%).
So sánh với thành phần chính của tinh dầu bởi bung của các tác giả [21] là limonen (31,7%), β- pinen (24,4%), β- caryophyllen (11,1%)- (gọi là chemotype 1) và [6] có thành phần chính là limonen (31,7- 42,4%), β - pinen (24,4 – 27,4%), β- caryophylen (3,5 – 11,1%)- (gọi là chemotype 2) nhận thấy cây bởi bung do chúng tôi nghiên cứu trên là một chemotype mới (chemotype 3: β- caryophylen (43,11%), β-bisabolen (12,62%) và β- elemen (11,73%) )
Hình 3.1: Sắc kí đồ mao quản GC của tinh dầu lá cây bởi bung (Glycosmis pentaphylla Corr.)
3. 2. Xác định cấu trúc của hợp chất A thu thu đợc từ thân cây bởi bung 3.2.1. Giải phổ chất A
Trớc khi đo phổ thì ta xác định định tính các nguyên tố có mặt trong phân tử. Để xác định các nguyên tố lạ khó nhìn thấy trong phổ nh: các halogen (trừ Br), S, kim loại, phốt pho… thì ta dùng phơng pháp định tính với thuốc thử thờng dùng. Tạo màu xanh beclanh để nhận biết nitơ, dùng mẫu thử lassaigue để nhận biết các halogen, lu huỳnh, phốt pho và nung trong không khí để xác định kim loại. Qua phép thử này cho ta thấy hợp chất A chỉ chứa C, H, O.
3.2.2. Dựa vào các tính chất hóa lý, phổ khối lợng, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC và HSQC
- Các tính chất hóa lý.
Hợp chất A là chất dạng tinh thể hình kim màu trắng hơi vàng, dễ tan trong CH3OH, CHCl3, nóng chảy ở 108-1090C.
- Từ phổ khối lợng của chất A cho thấy có 8 pic ion phân tử trong đó pic ion có m/z lớn nhất tơng ứng với [M+H]+ (positive) có khối lợng bằng 259 do đó ta suy ra khối lợng phân tử của A là MA= 258. (hình 3.2 và hình 3.3)
Hình 3.2: Phổ khối của chất A
Hình 3.3: Phổ khối của chất A
- Từ phổ 1H – NMR (500MHz, CDCl3) (hình 3.4 và hình 3.5) cho thấy chất A có 14 nguyên tử hiđro ở các tín hiệu sau:
- Tín hiệu có δ= 1.5 ppm, singlet có J=10Hz ứng với 6H của 2 nhóm -CH3 ở vị trí C4' và C5'.
- Tín hiệu có δ= 3,96 ppm, singlet có J=10Hz ứng với 3H của nhóm metoxy ở vị trí C8.
- Tín hiệu có δ=5,69 ppm, duplet có J=10Hz ứng với 1H ở vị trí C2'. - Tín hiệu có δ= 6,21 ppm, duplet có J=9,5Hz ứng với 1H ở vị trí C3. - Tín hiệu có δ= 6,81 ppm, singlet ứng với 1H ở vị trí C5.
- Tín hiệu có δ= 7,55 ppm, duplet có J=9,5Hz ứng với 1H ở vị trí C4. - Tín hiệu có δ= 6,31 ppm, duplet có J=10Hz ứng với 1H ở vị trí C1'.
Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của hợp chất A
Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của hợp chất A - Từ phổ 13C - NMR (125 MHz, CDCl3) (hình 3.6 - hình 3.8) cho thấy hợp chất A có 15 nguyên tử C, ở các tín hiệu: δ (ppm): 160,6 (C- 2); 113,2 (C- 3); 143,6 (C- 4); 113,0 (C- 4a); 119,1 (C- 5); 119,1 (C- 6); 121,1 (C- 1'); 131,2 (C- 2'); 77,8 (C- 3'); 28,2 (C- 4'); 28,2 (C- 5'); 149,3 (C- 7); 135,6 (C- 8); 148,3 (C- 8a); 61,3 (C- OCH3) .
Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của hợp chất A
Hình 3.8: Phổ 13C-NMR của hợp chất
Bảng 9: Số liệu phổ 1H - NMR, 13C – NMR của chất A Vị trí Nhóm δH (ppm; J,(Hz)) δc (ppm) Thí nghiệm δc (ppm) Tài liệu [14] 2 C 160,6 160,3 3 CH 6,21 (d; 9,5) 113,2 112,8 4 CH 7,55 (d; 9,5) 143,6 143,4 4a C 113,0 114,3 5 CH 6,81 119,1 120,8 6 C 119,1 118,9 7 C 149,3 148,8 8 C 135,6 135,1 8a C 148,3 147,9 1' CH 6,31(d;10,0) 121,1 118,9 2' CH 5,69 (d; 10,0) 131,2 130,9 3' C 77,8 75,5 4’, 5’' CH3 1,5 (s) 28,2 27,9 8-OCH3 OCH3 3,96 (s) 61,3 60,8 * Từ phổ HMBC (hình 3.9 - hình 3.11) cho các tơng tác H C; C2- H4; C2- H3; C8a- H4; C8a- H5; C7- H1, ; C7- H5; C8- H4; C8- H5; C1,- H5; C5- H4; C5- H1,; C6- H2,; C3- H4; C4a- H4; C4a-H3; C8- H4,; C8- H9; C2,- H5,; C1,- H4,; C1,- H5,; C5- H1,; C4a- H1,; C3,- H1,; C3,- H2,; C3,- H4,; C3- H5; C4,- H5,; C5,- H4’.
Hình 3.9: Phổ HMBC của hợp chất A
Hình 3.11: Phổ HMBC của hợp chất A
* Từ phổ HSQC (hình 3.12 và 3.13) cho các tơng tác HC; C3- H3; C4- H4; C5- H5; C1,- H1,; C2,-H2,; C4,- H4,; C5,- H5,, C9-H9.
Hình 3.13: Phổ HSQC của hợp chất A
* Tìm công thức phân tử của chất A nh sau:
Gọi công thức hợp chất A là CxHyOzNt (Điều kiện: x, y, z € N), nếu có nitơ thì phải là số chẵn vì MA=258t=số chẵn. Ta có phơng trình:
12x+y+16z+14t= 258 với x=15, y=14 16z+14t= 64
z=(64-14t):16t=0 và z=4. Vậy hợp chất A có công thức phân tử là :
C15H14O4
Kết hợp với, HMBC, HSQC và so sánh với số liệu của phổ tham khảo đã công bố [20] nhận thấy hợp chất A phù hợp với cấu trúc của chất luvangetin
có công thức cấu tạo là:
O O H3C H3C OCH3 O 1 2 3 4 5 4a 6 1' 2' 3' 4' 5' 7 8 8a 9 luvangetin
Chơng 4: Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu thành phần hoá học của cây bởi bung (Glycosmis pentaphylla Corr ) ở Nghệ An, chúng tôi thu đợc một số kết quả nh sau:
1. Bằng phơng pháp chng cất lôi cuốn hơi nớc thu đợc tinh dầu lá bởi bung ở Nghệ An chiếm 0,45% (so với mẫu tơi) và tinh dầu thu đợc chứa hơn 47 hợp chất, trong đó có 47 hợp chất đã xác định thành phần chính của tinh dầu cây lá cây bởi bung là: β-caryophylen (43,11%), β-bisabolen (12,62%), β- elemen (11,73%), β-selinen (5,33%), caryophylen oxit (3,03%) và α- copaen (2,39%). So sánh với thành phần chính của tinh dầu bởi bung của các tác giả [21] là limonen (31,7%), β- pinen (24,4%), β- caryophyllen (11,1%)- (gọi là chemotype 1) và [6] có thành phần chính là limonen (31,7- 42,4%), β- pinen (24,4 – 27,4%), β- caryophylen (3,5 – 11,1%)- (gọi là chemotype 2) nhận thấy cây bởi bung do chúng tôi nghiên cứu trên là một chemotype mới (chemotype 3: β- caryophylen (43,11%), β-bisabolen (12,62%) và β- elemen (11,73%) )
2. Bằng phơng pháp ngâm chiết mẫu với dung môi chọn lọc đã thu đợc cao metanol. Từ đó đã phân lập đợc các hợp chất A.
3. Đã xác định cấu trúc của các chất A bằng một số phơng pháp vật lý hiện đại nh: phổ EI-MS, 1H- NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC và phơng pháp so sánh với phổ chuẩn trong trong tài liệu [20].
Kết quả phân tích cho thấy hợp chất A là: luvangetin
Tài liệu tham khảo
Tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích và những ngời khác (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở