Nguyên tắc của phơng pháp này là dựa vào tính chất hấp phụ khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp cần tách vào một chất hấp phụ – pha tĩnh.
- Cột chạy sắc ký thờng dùng đợc làm bằng thuỷ tinh (Cột lắp thẳng đứng).
- Chất nhồi cột thờng dùng là silicagen không biến tính.
- Các dung môi rửa giải thờng dùng clorofoc, metanol, ete dầu hoả, diclometan, etylaxetat, axeton và hỗn hợp các dung môi này với tỉ lệ… thể tích khác nhau.
Khi chọn các dung môi cần chú ý các yếu tố sau:
- Hoà tan tơng đối tốt tất cả các cấu tử cần phân tích. - Bị hấp phụ tối thiểu trên pha tĩnh.
- Không phản ứng hoá học với chất tan cũng nh chất hấp phụ. - Độ tinh khiết của dung môi.
- Độ nhớt, độ bay hơi của dung môi.…
Thông thờng rửa giải liên tiếp bằng các hệ dung môi có khả năng giải hấp tăng dần (hay độ phân cực tăng dần).
Có thể tóm tắt nguyên tắc tiến hành sắc ký cột nh sau: Tuyến dung môi
Điểm xuất phát B B O O A A O O O O O Dung môi
Nhồi silicagen vào cột (nhồi khô hoặc nhồi ớt), sau đó cho hỗn hợp chất cần tách (đã đợc trộn với silicagen khô theo tỉ lệ 1 : 1) vào, trên cùng cho tiếp một lớp silicagen nữa và một lớp bông để tránh sự xáo trộn hỗn hợp mẫu chất và silicagen khi rót dung môi vào. Cho dung môi của hệ dung môi rửa giải vào cột; điều chỉnh khoá để dung dịch chảy ra khỏi cột với tốc độ dòng phải đồng đều. Cuối cùng tiến hành phân tích dung dịch chảy ra khỏi cột (Lu ý: Khi rót dung môi phải luôn ngập ở trên lớp bông và không nên rót thẳng vào thành cột mà rót qua thành phễu; Thời gian chạy cột không nên kéo dài vì các chất phân tích có thể bị biến tính).
Chơng II
Phơng pháp nghiên cứu
II.1. Phơng pháp lấy mẫu:
Mẫu tơi đợc lấy vào buổi chiều tối. Sau khi lấy về rửa sạch để nơi bóng râm, thoáng mát và phơi khô 2 tuần ở nhiệt độ phòng. Sau đó xử lý mẫu khô bằng cách ngâm với dung môi thích hợp thu đợc dịch chiết dùng cho nghiên cứu (sẽ nêu ở phần thực nghiệm).
II. 2. Phơng pháp phân tích, tách và phân lập các chất:
Các phơng pháp sử dụng trong quá trình phân tích, phân tách và phân lập các chất là:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Sắc ký cột thờng sử dụng silicagen (254 - Merck). - Các phơng pháp kết tinh phân đoạn.
II.3. Phơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất:
Cấu trúc của các hợp chất đợc khảo sát nhờ sự kết hợp giữa các phơng pháp phổ:
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H- NMR. - Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C- NMR.
- Phổ khối lợng bắn phá dòng electron (EI - MS). - Phổ mô phỏng ACD/HNMR; ACD/CNMR.
Phổ khối lợng EI – MS ghi trên thiết bị Engine 5989B – MS, dòng e có năng lợng 70 eV. Phổ 1H – NMR ghi trên thiết bị Brucker Advance tần số 500 MHz và phổ 13C - NMR ghi trên thiết bị Brucker Advance tần số 125 MHz, trong dung môi hỗn hợp CDCl3 – MeOD; ở nhiệt độ 3000K.
Chơng III Thực nghiệm III.1 Thiết bị và hoá chất:
III.1.1. Thiết bị:
- Bình thuỷ tinh ngâm mẫu 3l. - Bình cầu nút nhám hai cổ. - ống sinh hàn ruột thẳng.
- Bình tam giác (500ml, 250ml, 50ml). - ống đong (100ml, 10ml ).…
- Cốc thuỷ tinh. - Phễu thuỷ tinh. - Pipet, micro pipet. - Bếp điện. - Giá đỡ. - Cột sắc ký (dài 80cm, đờng kính 3cm, V cột 250ml). - Bình tia nớc. - Lọ thuỷ tinh 5ml. III.1.2. Hoá chất: - Metanol : CH3 OH. - Cloroform : CHCl3. - Axeton : CH3 CO CH3. - n – hexan: n – C6H14. - Etylaxetat: CH3 COO C2H5. - Nớc cất: H2O. III.2. Thực nghiệm: III.2.1. Thu hái mẫu:
Nụ và hoa vối đợc thu hái ở phờng Lê Mao, thành phố Vinh, tỉnh Nghệ An, vào đầu tháng 6 năm 2005 (thời kỳ hoa nở) đợc 1,5kg mẫu tơi. Mẫu sau khi lấy về đợc rửa sạch, phơi trong bóng râm cho đến khô, cân đợc 600 gam.
III.2.2. Chiết các hợp chất từ nụ và hoa vối khô; tách bằng phơng pháp sắc ký cột:
Ngâm 600g nụ và hoa vối khô (đã đợc nhiền nhỏ) vào 2500ml metanol trong bình cầu 3 lít ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 1 tháng. Sau đó lọc vào cốc cho bay hơi tự nhiên metanol (ở nhiệt độ bình thờng) đến thể tích 100ml, có kết tủa vàng tách ra dới đáy cốc, lọc và sấy khô trong không khí đợc cao metanol.
Sau đó trộn đều lợng cao metanol với silicagen theo tỉ lệ 1:1 rồi cho vào đầu cột sắc ký đã đợc nhồi bằng pha tĩnh silicagel (254 - Merck). Tiến hành sắc ký với các hệ dung môi triển khai theo tỉ lệ thay đổi (Bảng 7), lấy lần lợt những thể tích xác định dung dịch chảy ra khỏi cột. Cất thu hồi dung môi 1 phần, cho thêm một ít axeton vào phần thu đợc, để bay hơi tự nhiên và thu đợc các phân đoạn ở bảng sau:
Bảng 7: Số liệu của quá trình chạy sắc ký.
STT Hệ dung môi CHCl3/CH3OH Tỷ lệ Phân đoạn
1 CHCl3/CH3OH 100 : 0 1 -> 3
2 CHCl3/CH3OH 98 : 2 4 -> 20
3 CHCl3/CH3OH 97 : 3 21 -> 35
4 CHCl3/CH3OH 95 : 5 36 -> 63
5 CHCl3/CH3OH 90 : 10 64 -> 75
Khi chạy với hệ dung môi thứ tự (1) và (2) thì thấy cột sắc ký phân ra bốn đoạn với các màu khác nhau. Lớp trên cùng có màu đen; lớp thứ hai có màu trắng; lớp thứ ba có màu da cam; lớp th t có màu xanh đậm.
III.2.3. Tách, kết tinh lại thu đợc các chất rắn:
ở phân đoạn 5 tơng ứng với hệ dung môi 98 : 2 xuất hiện một chất rắn màu da cam. Chất rắn A tan tốt trong dung môi axeton nhng tan ít trong n – hexan. Vì vậy ta dùng n – hexan để rửa chất bẩn. Sau đó ta kết tinh lại chất rắn A trong axeton thì thu đợc tinh thể hình rẽ quạt màu da cam, ký hiệu mẫu HVT1 (Hình 2).
Hình 2: Chất A trong mẫu HVT1 thu đợc từ thực nghiệm.
ở phân đoạn 7 cũng tơng ứng với hệ dung môi 98:2, xuất hiện chất rắn B ở dạng bẩn với lợng khá lớn. Chất rắn B đợc rửa bằng n – hexan, nhng chỉ một phần chất bẩn bị hoà tan. Tiếp tục rửa chất rắn B bằng etylaxetat (chất rắn B tan ít trong etylaxetat) thu đợc chất rắn B ở dạng sạch hơn. Sau đó tiến hành kết tinh lại 3 lần chất rắn B trong metanol thu đợc chất rắn B sạch có màu trắng, ở dạng bông keo, ký hiệu mẫu HVT2.
ở phân đoạn 22, 23, 24 xuất hiện chất rắn C với lợng lớn, màu trắng. Phép thử bản mỏng cho thấy 3 phân đoạn này chứa cùng 1 chất. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành xử lý phân đoạn thứ 23 (do sạch hơn). Tiến hành rửa chất rắn C bằng n – hexan, chỉ rửa chất bẩn đợc 1 phần. Sau đó tiếp tục rửa chất rắn C bằng etylaxetat và axeton, chất C tan ít trong etylaxetat và aceton lạnh. Sau đó tiến hành kết tinh lại chất rắn C trong metanol nóng 3 lần thì thu đợc chất rắn C kết tinh ở dạng tinh thể màu trắng hình lập phơng, ký hiệu mẫu HVT3.
Sơ đồ phân lập và xác định dữ kiện về cấu trúc các chất đợc tách từ nụ và hoa cây vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb). Merr Et Perry).
Sắc ký cột thờng với hệ dung môi CHCl3/CH3OH
III.2.4. Xác định cấu trúc:
Xác định cấu trúc các hợp chất này bằng các phơng pháp phổ.
Chơng IV
Kết quả và thảo luận IV.1 Xác định cấu trúc hợp chất A trong mẫu HVT1:
Mẫu khô nghiền nhỏ