* ðối tượng
Khảo sát 8 dòng khoai tây nhị bội có nguồn gốc từ trung tâm nghiên cứu khoai tây bang Bayer - Cộng hoà liên bang ðức.
A15 A56 A16 A41 B186 B208 H1929/34 H1959/195 * Vật liệu Cây In vitro
Lá khoai tây và mầm củ bị nhiễm bệnh virus PVY ñược lấy ngoài ñồng ruộng.
Củ khoai tây nhị bội
Hoá chất dùng ñể lây nhiễm virus PVY (Phụ lục 1) Hoá chất dung ñể chạy ELISA (Phụ lục 2)
Hóa chất dùng ñể tách chiết ADN (Phụ lục 3) Hóa chất chạy PCR (Phụ lục 4)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 29
Bảng 3.1: Các mồi sử dụng trong ñánh giá sựña hình của các dòng khoai tây nhị bội Stt Tên mồi Trình tự mồi Ghi chú 1 GM339 PrimerF:GGTAGTTGGACGAGCA TAT PrimerR:CTCACTTTTAGACCAG ATTT Theo M.R. Marano [16],
GM339 nhân ñoạn ADN liên
kết với gen kháng virus X Nb 2 STM0003-111 PrimerF:AATTGTACTCTGTGTGT GTG PrimerR:GGAGAATCATAACAAC CAG
Theo Ye-Su Song [18],
STM0003-111 nhân ñoạn ADN liên kết chặt với gen kháng virus Y Rysto 3 STM0030 PrimerF:AGAGATCGATGTAAAA CACGT PrimerR:GTGGCATTTTGATGGA TT 4 STM0037 PrimerF:AATTTAACTTAGAAGA TTAGTCTC PrimerR:ATTTGGTTGGGTATGA TA 5 STM1104 PrimerF:TGATTCTCTTGCCTACT GTAATCG PrimerR:CAAAGTGGTGTGAAGC TGTGA 6 STM2013 PrimerF:TTCGGAATTACCCTCTG CC PrimerR:AAAAAAAGAACGCGC ACG 7 STPoAc58 PrimerF:TTGATGAAAGGAATGC AGCTTGTG PrimerR:ACGTTAAAGAAGTGAG AGTACGAC STM0030, STM0037, STM1104, STM2013,
STPoAc58 ñược lấy theo M.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 30
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.2.1. ðánh giá sự sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất của các dòng khoai tây nhị bội ngoài ñồng ruộng dòng khoai tây nhị bội ngoài ñồng ruộng
Thời vụ: Vụñông
Khoai tây ñược trồng vào ngày 15/11/2007 và thu hoạch vào ngày 10 tháng 2 năm 2008 tại nhà lưới Viện Sinh học Nông Nghiệp – Trường ðại học Nông Nghiệp I.
Thí nghiệm khảo sát không lặp lại Các chỉ tiêu theo dõi: ðịnh kỳ 7 ngày 1 lần
- Chiều cao cây (cm): ðo trực tiếp từ gốc ñến ñỉnh sinh trưởng. - Số lá trên cây (lá): Tổng số lá có trên cây tại thời ñiểm theo dõi. - Số nhánh trên khóm.
- ðặc ñiểm thân: Hình dạng, màu sắc, kích thước.
- ðặc ñiểm lá: Màu sắc, hình dạng, kích thước, số thuỳ trên lá, số tai lá trên lá.
- ðặc ñiểm củ: Hình dạng củ, kích thước, số mắt trên củ, ñộ sâu mắt củ, màu sắc vỏ củ, màu sắc ruột củ, màu sắc mắt củ.
- Hàm lượng các chất trong củ.
+ Hàm lượng ñường hoà tan: ðo bằng máy xác ñịnh hàm lượng ñường hòa tan trong dịch củ.
+ Hàm lượng tinh bột: ðược ñịnh lượng theo phương pháp thuỷ phân bằng axit. Dùng axit HCl thuỷ phân tinh bột thành ñường sau ñó chuẩn ñộ
lượng ñường bằng Iot .
+ Hàm lượng vitamin C: ðược ñịnh lượng theo phương pháp chuẩn ñộ Iot. - Chỉ số diện tích lá (LAI): ðo bằng phương pháp cân.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 31
Diện tích lá ño bằng cách lấy 1dm² giấy cân ñược khối lượng P1. In toàn bộ số lá lên giấy (giấy phải ñồng nhất), cắt phần giấy có hình của lá sau
ñó ñem cân ñược khối lượng P2. Diện tích lá S = P2/P1 (dm²). LAI = Tổng diện tích lá (m²)/ Tổng diện tích ñất (m²)
Chỉ tiêu diện tích lá ñược ño vào 3 thời ñiểm: 45 ngày, 60 ngày sau khi trồng và khi cây ngừng sinh trưởng.
- Thời gian sinh trưởng (ngày): Tính từ khi gieo trồng ñến khi cây ngừng sinh trưởng.
Các chỉ tiêu năng suất:
- Khối lượng trung bình củ (g/củ) = Tổng khối lượng củ/ Tổng số củ
thu hoạch
- Năng suất thực thu : Là số kg củ thu ñược trên một ñơn vị diện tích thí nghiệm.
- Năng suất lý thuyết (kg/ha) = Khối lượng củ/khóm (kg) x Số khóm/m² x 10000
- Phân loại củ theo ñường kính củ (Φ): 1cm, 2cm, 3cm, 4cm...
3.2.2. ðánh giá khả năng kháng virus PVY của các dòng khoai tây nhị bội
Thí nghiệm lây nhiễm ñược trồng tám dòng khoai tây nhị bội từ cây nuôi cấy mô trong bồn thuỷ canh, ở ñiều kiện nhà màn, cùng với giống thuốc lá C71 làm cây chỉ thị.
20 ngày sau khi trồng cây ñã sinh trưởng phát triển ổn ñịnh chúng tôi tiến hành kiểm tra ñộ sạch virus PVY của tám dòng nhị bội và cây thuốc lá bằng phản ứng (DAS – ELISA).
25 ngày sau khi trồng chúng tôi tiến hành lây nhiễm nhân tạo lần 1, tám dòng khoai tây nhị bội với dòng thuốc lá.
40 ngày sau khi trồng chúng tôi tiến hành lây nhiễm nhân tạo lần 2, tám dòng khoai tây nhị bội với dòng thuốc lá.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 32
* Phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Cách lây nhiễm dựa theo mô tả của Hill (1984) và Kado (1972) (Phụ lục 6) Double Antibody Sandwich (DAS) Enzyme – linked imunosorbent assay (ELISA) (Phụ lục 7).
3.2.3. ðánh giá sựña hình của các dòng khoai tây nhị bội nghiên cứu
* Phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN hệ gen:
Có nhiều phương pháp tách chiết ADN nhưng ở ñây chúng tôi chọn 2 phương pháp:
Phương pháp của GS. Hans – Joerg Jacobsen trường ðại học Hannover (Phụ lục 8)
Phương pháp CTAB (Phụ lục 9)
Thành phần phản ứng PCR (Phụ lục 10)
Phản ứng ñược thực hiện theo chu kỳ nhiệt (Phụ lục 11) Nhiệt ñộ gắn mồi (Tm) cho các mồi (Phụ lục 12)
* ðiện di dung dịch ADN tách chiết ñược và sản phẩm PCR:
ADN tách chiết ñược kiểm tra ñộ nguyên vẹn và tinh sạch trên gel agarose 1%. Sản phẩm PCR ñược kiểm tra trên gel agarose 3%.
ðệm chạy ñiện di: Dung dịch TAE 1x.
Bản gel sau khi chạy ñược nhuộm bằng Ethidium bromide và ñược chụp hiện hình bằng tia UV.
3.3. Phương pháp sử lý số liệu
ðọc kết quả ñã kiểm tra ñộ sạch virus PVY bằng máy ở bước sóng 405nm, và quan sát bằng mắt dưới ánh sáng bình thường.
Kết quả chạy SSR-PCR ñược xử lý theo phần mềm NTSYS pc 2.1 ñể
tính hệ số tương ñồng di truyền Jaccard và thiết lập mối quan hệ di truyền giữa các dòng khoai tây nghiên cứu. Các chỉ tiêu ño ñếm ñược xử lý kết quả
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 33