PHẦN IỊ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.3.1.2.Phương phỏp nghiờn cứu sự phỏt triển tuyến sinh dục
Xỏc ủịnh cỏc giai ủoạn phỏt triển tuyến sinh dục cỏ theo phõn loại của Sakun và Butskaia (1968) dựa trờn lỏt cắt mụ tế bàọ
Phương phỏp làm tiờu bản tuyến sinh dục ủược thực hiện dựa trờn phương phỏp của Sheckan và Hrapchak (1980) và quy trỡnh làm tiờu bản mụ học của Trung tõm Quan trắc và Cảnh bỏo Mụi trường, Bệnh thuỷ sản - Viện nghiờn cứu nuụi trồng Thủy Sản Ị
Số trứng thu ủược sau khi cỏ ủẻ Sức sinh sản thực tế
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………22
Sơủồ quy trỡnh làm tiờu bản mụ học ủược túm tắt như sau:
Cốủịnh mẫu tuyến sinh dục:
Mẫu ủược cố ủịnh bằng dung dịch ủịnh hỡnh Boin cú thành phần như sau: + 750 ml dung dịch acid picric bóo hoà.
+ 250 ml formalin 40% + 50 ml acid acetic
ðịnh hỡnh mẫu trong 24 giờ, sau ủú ngõm nước từ 1-3 giờ
Khử nước ở mẫu cốủịnh:
Lần lượt ủưa mẫu qua cồn Ethanol với cỏc nồng ủộ như sau:
Thu mẫu
Cốủịnh mẫu
(dung dịch Bouin)
Xử lý mẫu
Nhuộm mẫu
(Haematoxyline & Eosin) ðỳc mẫu (Parafine),
cắt mẫu
ðọc kết quả
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………23
+ Cồn 70% :1 lần 30 -60 phỳt
+ Cồn 95%: 3 lần, mỗi lần 30 - 60 phỳt + Cồn 100%: 3 lần, mỗi lần 30 -60 phỳt
Làm trong mẫu:
Mẫu ủó ủược khử nước và ủược làm trong bằng xilen + Xilen I: 1 lần trong 60 phỳt
+ Xilen II: 1 lần trong 60 phỳt
Thấm parafin: Mẫu ủó ủược làm trong chuyển vào Parafin ủun núng 56 - 580C
ðỳc Parafin:
+ Sử dụng mỏy ủể ủổ Parafin làm núng chảy vào khuụn ủó cú mẫu, sau ủú ủặt khuụn lờn dàn lạnh cho Parafin ủụng lại tạo ra khối Parafin cú chứa mẫụ Nờn giữ mẫu tập trung ở một mặt khuụn ủể khi cắt ủược thuận tiện.
+ Cắt gọt khối Parafin cú chứa mẫu: Dựng dao mỏng cắt gọt bỏ những phần Parafin thừa vào mặt của khối mẫu sõu vào 3 -5 micrometer. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cỏt lỏt mẫu:
+ Gắn khối Parafin chứa mẫu vào mỏy Microtom. + Tiến hành cắt những lỏt mụ dày 5 -7 micrometer
+ ðưa lỏt cắt vào nước ấm (40 -500C) khoảng 1- 2 phỳt ủể lỏt cắt gión ra, khụng bị nhăn (cú thể cho vào một ớt lũng trắng trứng gà).
+ Dựng slide (lam) kớnh ủể lấy lỏt cắt ra khỏi nước.
+ ðặt lờn mỏy sấy slide ở nhiệt ủộ 40 - 600C trong thời gian 1- 4 giờ, tuỳ theo nhiệt ủộ.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nụng nghiệp ………24
Nhuộm Hematoxylin và Eosin:
+ Loại bỏ Parafin ở lỏt cắt bằng Xilen I: 5 phỳt; Xilen II: 5 phỳt. + Làm no nước mẫu: + Cồn 100%: 2 lần 2 - 3 phỳt + Cồn 95%: 2 lần, mỗi lần 2 - 3 phỳt + Cồn 80%: 2 lần, mỗi lần 2 - 3 phỳt + Cồn 50%: 1 lần, 2 - 3 phỳt + Nhỳng trong nước ló 3 - 6 lần
Nhuộm Hematoxylin - Mayer : 4 -6 phỳt + Nhuộm Eosin : 2- 3 phỳt + Làm mất nước mẫu: + Cồn 100%: 2 - 3 phỳt + Cồn 95%: 2 - 3 phỳt
+ Làm trong mẫu: Xilen I: 2 - 3 phỳt; Xilen II : 2- 3 phỳt
Dựng lamen sạch dỏn lờn làm mẫu bằng Bouin Canada ủể bảo quản và quan sỏt dưới kớnh hiển vi ủiện tử.