4. ðố it ượng, ñị añ iểm và thời gian nghiên cứu
2.1.3. Nguồn bệnh HXVK dùng cho nghiên cứ u
Bao gồm những isolates của bệnh HXVK ựã phân lập ựược từ một số
vùng trồng cà chua chắnh ở Hà Tây, Hà Nội, Vĩnh Phúc.
Phân lập và nhận biết vi khuẩn R.solanacearum chúng tôi sử dụng môi trường TZC (Triphenyl Tetrazolium Chloride) (A.Kelman, 1954)[51]. Trên môi trường này vi khuẩn R.solanacearum có màu trắng xung quanh, rìa mép nhẵn ở giữa có màu hồng nhạt, khuẩn lạc ựột biến có màu ựỏ. Các vi khuẩn khác không có màu như vậy.
Thành phần của môi trường TZC ựể nhận biết vi khuẩn
R.solanacearum như sau: Pepton 10,0g Casein hydrolysate 1,0g Glucose 5,0g Agar 12,0g Nước cất 1000ml pH = 7-7.2
Khi khử trùng ở 1210C trong 45 phút. Trước khi môi trường còn ấm khoảng 600C thêm 1ml dung dịch 1% 2:3:5 Triphinitetrazo chlorit (TZC) vào 200ml môi trường. Pha chế dung dịch TZC và khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc vi khuẩn.
Có rất nhiều môi trường ựể nhân nhanh vi khuẩn R.solanacearum . Tuy nhiên trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng môi trường SPA (Sucrose pepton agar).
Thành phần của môi trường SPA (Sucrose pepton agar) ựể nhân nhanh vi khuẩn R.solanacearum .
Saccarose 20.0g
K2HPO4 0.5g MgSO4 0.25g Agar 15.0g Nước cất 1000ml pH= 7.2-7.4 2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1.Tình hình kinh tế - xã hội huyện đan Phượng năm 2007.
2.2.2. điều tra và thu nhập mẫu bệnh HXVK tại Hà Nội, Hà Tây, Vĩnh
Phúc.
2.2.3.Phân lập mẫu bệnh HXVK trong phòng thắ nghiệm 2.2.4. điều tra diễn biến bệnh HXVK ngoài sản xuất
2.2.5. Thử nghiệm hiệu quả các chế phẩm sinh học trong phòng trừ bệnh HXVK ở nhà lưới.
2.2.5.1. Ảnh hưởng của các chế phẩm ựến khả năng nảy mầm và
sinh trưởng của hạt cà chua giống VL2004.
2.2.5.2. Ảnh hưởng của các chế phẩm ựến sự sinh trưởng, phát triển của cà chua giống VL2004.
2.2.5.3. Hiệu quả của các chế phẩm sinh học ựối với bệnh HXVK. 2.2.5.4. Ảnh hưởng của các chế phẩm sinh học ựến tỷ lệ bệnh HXVK trên cà chua.
2.2.6. Thử nghiệm hiệu quả của các chế phẩm sinh học trong phòng trừ bệnh HXVK trên cà chua ngoài ựồng ruộng diện hẹp.
2.2.6.1. Ảnh hưởng của các chế phẩm sinh học ựến khả năng nảy
mầm và sinh trưởng của hạt cà chua.
2.2.6.2. Ảnh hưởng của các chế phẩm sinh học ựến sự sinh trưởng và năng suất của cà chua giống Cherry.
2.2.6.3. Hiệu quả của các chế phẩm sinh học EXTN-1, BC, BE, Phân VSVCN ựến tỷ lệ bệnh HXVK.
2.2.6.4. Ảnh hưởng của các chế phẩm sinh học ựến sự sinh trưởng và năng suất của cà chua giống VL2004.
2.2.7. đánh giá hiệu quả của các chế phẩm sinh học trong thử nghiệm so
với ruộng ngoài sản xuất.
2.2.7.1. Hiệu quả kinh tế của các chế phẩm sinh học trong thử nghiệm và ngoài sản xuất tại đan Phượng, Hà Tây.
2.2.7.2. Hiệu quả kinh tế của các chế phẩm sinh học trong thử nghiệm và ngoài sản xuất tại Mê Linh, Vĩnh Phúc.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp ựiều tra, thu thập mẫu bệnh HXVK
- Phương pháp ựiều tra cơ bản theo phương pháp nghiên cứu BVTV
ở quyển I, II, III ấn hành năm 1998 của Viện BVTV, tiêu chuẩn bảo vệ
thực vật [15].
- điều tra trên diện rộng: điều tra ựược tiến hành trên ựồng ruộng ở các giai ựoạn sinh trưởng khác nhau. Tại vùng ựiều tra tiến hành ựiều tra theo phương pháp 5 ựiểm chéo góc, mỗi ựiểm ựiều tra 50 cây, các ựiểm ựược lựa chọn hoàn toàn ngẫu nhiên. Dựa trên các triệu chứng ựiển hình cùng với một
số phương pháp xác ựịnh nhanh trên ựồng ruộng ựể nhận biết cây bị nhiễm bệnh HXVK trong tổng số cây ựiều tra.
Thời gian ựiều tra ngoài ựồng bắt ựầu khi cây bắt ựầu hồi xanh (khoảng 20 ngày sau trồng) cho ựến khi thu hoạch (ựến khi không còn xuất hiện thêm cây bị bệnh).
Các mẫu có triệu chứng bệnh HXVK ựiển hình trên ựồng ruộng trước khi thu nên tiến hành kiểm tra nhanh về triệu chứng của VKHX trên ựồng ruộng: cắt ngang ựoạn gốc thân bị bệnh thấy có mô dẫn màu thâm ựen, nhúng vào cốc nước sạch thì có dòng dịch trắng như sữa chảy ra. Tiến hành thu ựoạn thân ựó, cho vào túi sách có nhãn ghi các thông tin về nơi lấy mẫu, ngày lấy mẫu giống cây, số thứ tự của mẫu, Ầ
Các mẫu sau khi thu vềựược sửa sạch, sát trùng bằng cồn, sau ựó dùng dao vô trùng cắt thành ựoạn nhỏ hoặc bổ ngang thân cây ựem ngâm vào trong
ống tắp ựựng nước cất vô trùng. Sau khoảng 20 phút bỏ các ựoạn thân ra khỏi
ống thu ựược dịch vi khuẩn. Có thể tiến hành phân lập ngay.
2.3.2 Phương pháp phân lập mẫu bệnh HXVK
Phân lập vi khuẩn R.solanacearum theo phương pháp của Kelman A., 1954[51] .Mẫu bệnh lấy từ thân cây có triệu chứng héo rũựột ngột, ở gốc nhổ
lên có màu nâu ựen, có mùi. Mẫu bệnh ựược khử trùng rồi lấy dịch cấy lên mội trường TZC. Phân lập vi khuẩn héo xanh ựược tiến hành trên môi trường TZC ựể nhận biết vi khuẩn thông qua hình dạng và màu sắc khuẩn lạc trên môi trường, phương pháp ựược tiến hành như sau: Pha loãng dịch khuẩn thu
ựược với dung dịch ựệm (0.1% muối KCL) hòa loãng ựể ựạt nồng ựộ thắch hợp sao cho có thể thu ựược khuẩn lạc riêng biệt sau khi cấy trên môi trường TZC . Sau ựó ựể ở tủ ựịnh ôn, nhiệt ựộ khoảng 28 - 300C ựể vi khuẩn phát
khuẩn lạc riêng rẽ ựể cấy trên môi trường theo kiểu zắch zắc, hoặc trang trên môi trường ựể chọn khuẩn lạc ựơn. Sau ựó thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá và thử lại trên cây cà chua ựể kiểm tra triệu chứng ựặc trưng cho bệnh HXVK.
2.3.3. Phương pháp, kỹ thuật sử dụng ựể thử nghiệm các chế phẩm
sinh học trên cà chua ở nhà lưới và ngoài ựồng.
Thử nghiệm các chế phẩm sinh học ở nhà lưới, ngoài ựồng và lây nhiễm nhân tạo VSV gây bệnh theo phương pháp nghiên cứu của BVTV ở
quyển I, II, III ấn hành 1997, 1998 của Viện BVTV; tiêu chuẩn Bảo vệ thực vật tập I, II của tuyển tập Tiêu chuẩn nông nghiệp Việt Nam[25] và phân bón của tập III Tiêu chuẩn Phân bón, tuyển tập Phân bón tiêu chuẩn Nông nghiệp Việt Nam, 2001[26].
*Phương pháp bố trắ thử nghiệm ở nhà lưới
+ Các thắ nghiệm ựược bố trắ theo khối ngẫu nhiên. Thắ nghiệm ựược tiến hành trên 2 giống cà chua là: VL2004 và Cherry. Mỗi giống chọn 5 công thức với 3 lần nhắc lại, 15 cây/lần nhắc.
+ Khoảng 9-12 ngày sau ựó tiến hành lây bệnh cho cây theo phương pháp sát thương hoặc tiêm dịch khuẩn vào nách lá thứ 3 từ trên xuống với liều lượng 5ml dung dịch vi khuẩn R.solanacearumở 108CFU/ml. Sau 8-10 ngày sau sẽ xử lý chế phẩm sinh học.
* Phương pháp thử nghiệm các chế phẩm sịnh học ựối với bệnh HXVK
ở ngoài ựồng diện hẹp 500m2
+ Các thắ nghiệm ựược bố trắ theo khối ngẫu nhiên. Thắ nghiệm ựược tiến hành trên 2 giống cà chua là: VL2004 và Cherry. Mỗi giống chọn 5 công thức, mỗi công thức 1 luống 40m2 với 3 lần nhắc lại, theo dõi 30 cây/lần nhắc.
Thử nghiệm các chế phẩm sinh học ựối với bệnh HXVK trên cà chua ở ngoài
ựồng tại xã Tiền Phong Ờ Mê Linh ỜVĩnh Phúc và xã Phương đình Ờ đan Phượng, Hà Tây
* Chỉ tiêu theo dõi
- Tắnh tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh sau 10, 20, 30, 40, 50...sau khi xử lắ chế phẩm ở nhà lưới và 10, 30, 50, 70, 90, Ầngoài ựồng.
- Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển qua các giai ựoạn và năng suất của cây cà chua.
Tiến hành theo dõi theo công thức + Tỷ lệ bệnh: TLB(%) = B A x 100 Trong ựó : TLB Ờ Tỷ lệ bệnh tắnh bằng % A Ờ Tổng số cây bị nhiễm B- Tổng số cây thắ nghiệm + Chỉ số bệnh: CSB (%) = k n v ni i ừ ừ ∑( ) x 100 Trong ựó: CSB - Chỉ số bệnh % Σ (ni x vi) - tổng tắch số cây bị bệnh với trị số cấp bệnh tương ứng k - trị số cấp bệnh cao nhất
n - Tổng số cây theo dõi)
Chỉ số bệnh HXVK do vi khuẩn R.solanacearum theo thang ựánh giá phân theo 5 cấp của French E.P. & L. De Lindo, 1982 [44].
Cấp 1: Một vài lá bị héo
Cấp 2: Nửa số lá phắa trên của cây bị héo Cấp 3: 3/4 số lá trên cây bị héo
Cấp 4: Cây hoàn toàn héo và chết
+ Cách tắnh năng suất: Các thử nghiệm ngoài ựồng ựều ở diện hẹp nên khi tắnh năng suất, cân toàn bộ khối lượng của tất cả các quả của cây thu ựược trong 3 lần nhắc, ựơn vị tắnh là kg, sau ựó quy ựổi thành ựơn vị tấn/ha.
*Cách xử lắ chế phẩm trước khi gieo
+ Ngâm hạt gieo vào dung dịch chế phẩm với liều lượng 1ml/1l của chế phẩm EXTN-1 ở mật ựộ 107 CFU và 2-3g/1l chế phẩm BC, BE, phân VSVCN ở mật ựộ 108 CFU/1g ngâm hạt trong dung dịch chế phẩm 50 - 60 phút, sau ựể ra bát cho hạt hơi se mục ựắch vi khuẩn tạo màng bọc lấy hạt ựể
hạn chế vi khuẩn héo xanh xâm nhập rồi ựem gieo.
*Cách xử lắ chế phẩm sau khi trồng
+ Trước khi trồng cà chua nên xử lý ựất, bỏ xung quanh gốc cây trồng
ựối với chế phẩm EXTN-1 liều lượng 5 lắt/ha và chế phẩm BC, BE với liều lượng 130 - 150 kg/ha, phân VSVCN với liều lượng 200 kg/ha. Có thể tuỳ
thuộc vào mức ựộ nhiễm bệnh HXVK, bệnh nặng nên bón bổ sung sau khi trồng 30-40 ngày với liều lượng 1/2 lượng bón trước.
* Các số liệu ựược xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học thắch hợp. Sử dụng phần mềm IRRISTAT 4.0 dùng cho khối nông học.
CHƯƠNG III- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. điều tra tình hình kinh tế - xã hội Huyện đan Phượng năm 2007
Huyện đan Phượng là một huyện thuần nông của tỉnh Hà Tây, bao gồm 16 xã, thị trấn. Kết quảựiều tra về tình hình kinh tế - xã hội của các xã ựược trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2: Tình hình kinh tế-xã hội huyện đan Phượng, Hà Tây năm 2007
Stt Tên Xã Dân số trung Bình (người)
Diện tắch ựất nông nghiệp (ha)
Diện tắch ựất trồng cà chua (ha) 1 Thị Trấn 8.539 166,8 0 2 Trung Châu 7.812 230,91 6,9 3 Thọ An 9.342 299,53 0,2 4 Thọ Xuân 8.425 264,64 0,31 5 Hồng Hà 10.985 206,15 1,62 6 Liên Hồng 6.330 131,79 0,83 7 Liên Hà 7.350 161,75 0,1 8 Hạ Mỗ 7.492 256,38 0,52 9 Liên Trung 6.753 135,14 0 10 Phương đình 10.917 399,67 18,8 11 Thượng Mỗ 7.741 256,49 2,14 12 đan Phượng 7.398 240,4 0,8 13 Tân Hội 16.902 406,74 0 14 Tân Lập 13.958 379,29 0 15 đồng Tháp 6.647 172,78 0,62 16 Song Phượng 4.131 142,63 6,8 Tổng số 140.722 3.851,09 42,64
Qua bảng 3.2 cho thấy với diện tắch 3.851,09ha ựất nông nghiệp nằm ở rải rác 16 xã, thị trấn. Về cơ bản sản xuất nông nghiệp vẫn giữ vai trò chắnh trong nền kinh tế của huyện. Trong ựó, diện tắch trồng cà chua chiếm 42,64 ha ựạt doanh thu 7 Ờ 8 tỷựồng/năm.
Song Phượng và Phương đình là hai xã có diện tắch trồng cà chua cao nhất huyện: Phương đình 18,8ha; Song Phượng 6,8ha. Tập quán trồng cà chua của nhân dân ở ựây ựã có từ lâu ựời, mang lại giá trị kinh tế cao, nhưng những ảnh hưởng của bệnh HXVK ựến năng suất, thì nông dân chưa có giải pháp tối ưu.
Triệu chứng của bệnh HXVK có thể quan sát thấy từ giai ựoạn cây con
ựến 1 Ờ 2 lá thật. đầu tiên các lá ngọn héo rũ xuống giống như bị giội nước sôi. Ban ựêm cây có thể phục hồi lại, nhưng nếu bị nặng sau ựó toàn bộ lá, thân cây héo nhanh chóng và cây chết, lá không rụng.
Nếu cây bị bệnh ở giai ựoạn ra hoa trởựi thì lúc ựầu các lá ngọn bị héo, có thể bị héo một cành hoặc một nhánh, sau ựó lan dần xuống phắa gốc làm cho toàn bộ thân cây héo và gục xuống, lá không rụng vẫn giữ ựược màu xanh. Rễ của cây bị nhiễm bệnh nặng ựầu chóp rễ teo thóp lại. Nếu cắt ngang thân hoặc rễ chắnh sẽ thấy các bó mạch dẫn có màu nâu ựen. đem ngâm rễ
chắnh cắt ngang của cây bị bệnh vào cốc thuỷ tinh ựựng nước sạch, sẽ thấy dòng vi khuẩn màu trắng sữa tuôn ra. đây là ựặc ựiểm rõ nét nhất dùng ựể
chuẩn ựoán nhanh bệnh héo xanh vi khuẩn và cũng ựể phân biệt với các bệnh héo chết cây nhưng nguyên nhân không phải do vi khuẩn.
Triệu chứng cà chua bị bệnh HXVK, cách nhận biết nhanh bệnh HXVK thể
3.2. điều tra thu thập mẫu bệnh HXVK trên cà chua tại Hà Tây, Hà Nội, Vĩnh Phúc vụ thu ựông năm 2008
Ở miền Bắc nước ta, cà chua ựược trồng chủ yếu ở vụ Thu đông (tháng 7-11) do vụ này cà chua ựạt năng suất cao và ắt bị bệnh.
Tiến hành ựiều tra tình hình bệnh HXVK trên cà chua ở một số xã của Hà Tây, Hà Nội, Vĩnh Phúc. Kết quả cho thấy ở hầu hết các ựiểm ựiều tra ựều bị
nhiễm bệnh với mức ựộ nhiễm khác nhau. Kết quảựược trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3: Kết quảựiều tra thu thập mẫu bệnh HXVK trên cà chua tại một số
xã ở Hà Tây, Hà Nội và Vĩnh Phúc vụ thu ựông năm 2008 địa ựiểm ựiều tra
Số lượng mẫu thu ựược Tỷ lệ bệnh nơi ựiều tra (%)
Chân ựất và luân canh với các cây trồng khác Song Phượng Ờ đan Phượng Ờ Hà Tây 25 10 - 12 đất nội ựồng luân canh với lúa nước Phương đình - đan Phượng - Hà Tây 25 8 - 11 đất nội ựồng luân canh với cây hành, tỏi Cổ Loa Ờ đông Anh -
Hà Nội 25 28 - 44
đất nội ựồng luân canh với cây trồng họ cà Vân Nội Ờ đông Anh
Ờ Hà Nội 25 25 - 38 đất nội ựồng luân canh với cây họ cà Tiền Phong Ờ Mê Linh Ờ Vĩnh Phúc 25 10 - 14 đất nội ựồng luân canh với cây lúa nước Tráng Việt Ờ Mê
Linh Ờ Vĩnh Phúc 25 28 - 32
đất bãi ven sông luân canh với cây họ cà
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy bệnh HXVK có thể gây hại trên tất cả các loại ựất trồng ở các vùng ựiều tra, ựặc biệt ở ựất bãi vên sông có tỷ lệ bệnh cao hơn. Bệnh gây hại nặng nhẩt trên ựất trồng luân canh với cây trồng họ cà ở các vụ trước. Các vùng trồng cà chua luân canh với lúa nước thì tỷ lệ bệnh thấp hơn. đặc biệt cây cà chua ựược luân canh với cây hành, tỏi vụ trước thì tỷ lệ
bệnh thấp.
3.3. Phân lập mẫu bệnh HXVK
Từ 150 mẫu bệnh ựã thu ựược tại các ựiểm ựiều tra chúng tôi tiến hành phân lập, chọn lọc những nguồn bệnh có ựộc tắnh cao làm vật liệu nghiên cứu. Các mẫu bệnh ựược phân lập trên mội trường TZC. Trên môi trường này khuẩn lạc của vi khuẩn R.solanacearum gây bệnh héo xanh có ựặc ựiểm là nhầy, màu trắng kem, rìa mép nhẵn ở giữa có màu phớt hồng. Sau ựó lại tiến hành thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá sau 24h. Phản ứng dùng ựể