Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. Nội dung nghiên cứu
1. Điều tra thực trạng hoạt động giết mổ động vật tiêu thụ nội địa và xuất khẩu tại Hải Phòng.
2. Xác định một số vi khuẩn ô nhiễm nguồn n−ớc sử dụng, gồm chỉ tiêu:
- Tổng số vi khuẩn hiếu khí (TSVKHK) - E. coli
- Clostridium perfringens
3. Xác định mức độ ô nhiễm TSVKHK trong không khí tại cơ sở giết mổ. 4. Xác định mức độ ô nhiễm vi khuẩn trong thịt gia súc ở cơ sở giết mổ bao gồm chỉ tiêu: - Tổng số vi khuẩn hiếu khí -Coliforms - E. coli - Staphylococcus aureus - Salmonella - Clostridium perfringens
* Thí nghiệm đ−ợc thực hiện tại Cơ quan Thú y vùng II, Hải Phòng. 3.2. Nguyên liệu nghiên cứu
- Mẫu n−ớc, không khí đ−ợc lấy tại một số cơ sở giết mổ xuất khẩu và tiêu thụ nội địa tại thành phố Hải Phòng.
- Mẫu thịt lấy tại các cơ sở giết mổ vào lúc 4h30 - 5h sáng. 3.2.2. Môi tr−ờng nuôi cấy vi khuẩn
Sử dụng môi tr−ờng nuôi cấy vi khuẩn của h2ng Merk (Đức), Ofoxd (Anh), gồm các loại:
- Môi tr−ờng lỏng: canh thang đệm pepton, canh thang CLP (Canh thang Lactose đỏ Phenol), BHI (Brain Hart Infusion), Muller kauffmam.
- Môi tr−ờng thạch: thạch th−ờng, thạch máu, Endo, SS (Salmonella
Shigella agar), Bair - parker, Chapman, Macconkey, Winson blair. 3.2.3. Thiết bị, máy móc, dụng cụ hoá chất dùng trong thí nghiệm
- Thiết bị: tủ ấm, tủ lạnh, tủ mát, tủ hấp sấy, nồi cách thuỷ, cân, buồng cấy vô trùng, kính hiển vi.
- Máy đồng nhất mẫu Stomacher, máy dịnh danh vi khuẩn Vitek.
- Dụng cụ: pipet, ống nghiệm, chai lọ các loại,...và hoá chất cần thiết cho phòng thí nghiệm vi sinh vật.
3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Ph−ơng pháp điều tra
Lập phiếu điều tra, thiết lập bảng biểu thu thập số liệu về thực trạng hoạt động giết mổ; điều tra dịch tễ; có câu hỏi phỏng vấn những ng−ời liên quan đến nội dung nghiên cứu của đề tài. Sử dụng ph−ơng pháp thống kê chuyên môn.
3.3.2. Ph−ơng pháp xét nghiệm
- Khái niệm về máy Vitek: là hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý điện tử, hoạt động hoàn toàn tự động, có khả năng định danh hơn 300 loại vi khuẩn khác nhau và thực hiện test kháng sinh đồ đối với hầu hết các loại kháng sinh. Hệ thống Vitek gồm 2 phần chính: modul phần cứng và bộ card chứa hóa chất có sẵn.
- Modul phần cứng gồm bộ phận bơm mẫu, bộ phận đọc và ủ, bộ phận kiểm soát trung tâm, máy so mầu, máy in, nguồn l−u điện.
- Card chứa hoá chất có sẵn, kích th−ớc bằng thẻ tín dụng gồm 30 - 45 khe rất nhỏ phân phối cơ chất hoặc kháng sinh để định danh vi khuẩn hay làm test kháng sinh đồ. Bộ card định danh đ−ợc công thức hoá bởi tác nhân sinh hoá đặc biệt phù hợp với nghiên cứu. Từng card định danh chứa đựng hoá chất đảm bảo thực hiện 30 phản ứng sinh vật hoá học. Card xác định kháng sinh đồ phủ ít nhất 10 loại thuốc kháng sinh cô đặc đ2 đ−ợc lựa chọn.
- Nguyên lý hoạt động: máy Vitek hoạt động nhờ hệ thống quang học tự động quét quá trình phát triển động học của vi khuẩn. Các phản ứng sinh học xảy ra trong bộ card chứa hóa chất có sẵn sau mỗi giờ. Căn cứ vào hệ thống các phản ứng sinh học, phần mềm máy tính computer phân tích định danh vi khuẩn và ghi lại kết quả.
- Các b−ớc xác định vi khuẩn bằng máy Vitek Chuẩn bị chủng vi khuẩn:
+ Vi khuẩn cần định danh phải thuần nhất, tức là chọn khuẩn lạc tách biệt trên môi tr−ờng agar thích hợp.
+ Vi khuẩn đ−ợc nuôi cấy trên đĩa thạch 18 - 24h; nhuộm Gram hoặc thử KOH 0,3% tr−ớc khi chọn card định danh cho phù hợp.
Nếu vi khuẩn là Gram(+), sử dụng card GPI (Gram Positive Identification); nếu vi khuẩn là Gram(-) thì sử dụng card GNI (Gram Negative Identification).
- Đánh số card:
+ Với vi khuẩn Gram âm làm phản ứng oxydaza: nhỏ một giọt n−ớc sinh lý lên phiến kính trộn đều với một khuẩn lạc điển hình. Dùng giấy tẩm oxydaza đặt lên trên nếu xuất hiện màu xanh tím là phản ứng d−ơng tính, không chuyển màu là phản ứng âm tính. Tr−ờng hợp phản ứng d−ơng tính đánh dấu vào ô O trên card GNI, âm tính thì để trống ô đó.
+ Với vi khuẩn Gram (+) làm phản ứng catalaza: nhỏ một giọt H2O2 lên
phiến kính, lấy một khuẩn lạc điển hình trộn đều. Nếu không thấy hiện t−ợng gì thì phản ứng là âm tính, có hiện t−ợng sủi bọt (trong thời gian 5 - 10 phút) là phản ứng d−ơng tính (nếu thời gian v−ợt quá 10 phút có thể là d−ơng tính giả). Tr−ờng hợp phản ứng catalaza d−ơng tính thì đánh vào ô O trên card GPI. Sau đó làm tiếp phản ứng đông huyết t−ơng (coagulaza), phản ứng d−ơng tính h2y đánh dấu vào ô bầu dục phía d−ới.
Nếu phản ứng catalaza âm tính để trống ô đó, làm tiếp phản ứng dung
huyết β- hemolyzit. Khi phản ứng dung huyết β- hemolyzit d−ơng tính thì đánh
dấu vào ô bầu dục ở phía d−ới, phản ứng âm tính thì để trống. Ví dụ: card có catalaza (+), coagulase (+)
- Cách pha hỗn dịch vi khuẩn:
+ Cho vào ống nghiệm 1,8ml dung dịch NaCl 0,85% bằng xi lanh chuẩn hoá.
+ Kiểm tra độ trong suốt của ống nghiệm chứa n−ớc muối trên máy colorimeter, điều chỉnh ở hai mức 0%T và 100%T, sau đó cho vi khuẩn vào ống (tuỳ loại card mà cho l−ợng vi khuẩn thích hợp).
+ Chọn 1 - 2 khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa n−ớc muối sinh lý ở trên. Đối với card GPI nồng độ vi khuẩn trên máy colorimeter đạt 80 - 88%T (vạch đỏ). Đối với card GNI nồng độ vi khuẩn trên máy colorimeter đạt từ 67 - 77%T (vạch xanh da trời).
- Nạp vi khuẩn vào card: + Nối ống hút vào card.
+ ấn chặt lỗ card ở bên s−ờn, cắm ống hút vào ống nghiệm chứa vi
khuẩn theo đúng thứ tự card định danh.
+ Đặt card và ống nghiệm lên giá đỡ, đặt đúng chiều sao cho miệng ống hút sát với đáy ống nghiệm thì mới hút đủ l−ợng vi khuẩn vào card và không tạo thành bọt khí trong card.
+ Cho toàn bộ vào máy hút chân không của máy Vitek. + Chờ 2 - 3 phút máy tự động hút vi khuẩn vào card.
+ Sau đó rút bỏ ống hút, nút lại lỗ card bằng nút nhựa rồi đ−a vào máy đọc. - Kiểm tra card trong máy ủ:
+ Từ màn hình chính, nhấn Vitek. + Chọn Reader 1.
- Đọc kết quả:
+ Thông th−ờng máy tự động đọc và đ−a ra kết quả nếu %Id > 80%. Máy sẽ tự động đ−a ra loài vi khuẩn và tự động chuyển sang phần mềm quản lý Bio - Lasion.
+ Chuyển đổi kết quả:
Tất cả các card chỉ có giá trị khi còn trong máy, nếu bỏ ra mà ch−a chuyển sang chế độ Trans, kết quả sẽ bị mất. Vì vậy chỉ bỏ card định danh ra ngoài khi đ2 chuyển kết quả sang chế độ Trans.
Sử dụng ph−ơng pháp lấy mẫu và xét nghiệm vi khuẩn nguồn n−ớc theo quy trình của Viện y học lâm sàng và vệ sinh môi tr−ờng (2002) [39], TCVN 2680 - 1978 [30].
▪ Ph−ơng pháp lấy mẫu:
- Lấy mẫu n−ớc tại vòi n−ớc máy: cần mở n−ớc chảy hết cỡ trong vòng 2 - 3 phút. Đóng vòi và khử khuẩn kỹ vòi n−ớc bằng nhiệt độ bông cồn. Mở lại vòi cho chảy mạnh 1 - 2 phút rồi điều chỉnh chảy vừa đủ để lấy mẫu vào chai nút mài 500ml đ2 đ−ợc hấp, sấy tiệt trùng. Thao tác lấy mẫu cần phải vô trùng, mẫu đ2 lấy phải bảo quản lạnh sau đó chuyển về phòng thí nghiệm.
- Lấy mẫu tại bể chứa n−ớc: khử trùng giá cây inox bằng cồn 70 độ, đặt chai nút mài 500ml (đ2 đ−ợc hấp, sấy tiệt trùng) có buộc dây ở nắp vào giá cây treo. Thả chai lấy mẫu xuống độ sâu khoảng d−ới 0,3 - 0,5m, giật dây nút mài để n−ớc chảy vào đầy chai thì kéo lên, nghiêng cây giá đổ bớt phần n−ớc trong chai mẫu, đậy nút mài và ghi nh2n lấy mẫu. Bao gói, bảo quản lạnh và đ−a mẫu về phòng thí nghiệm.
▪ Ph−ơng pháp nuôi cấy xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí:
Theo ph−ơng pháp đổ đĩa (Koch), mẫu n−ớc pha lo2ng ở đậm độ khác
nhau: 10-1, 10-2, 10-3,... tuỳ theo độ sạch bẩn để quyết định mức độ pha lo2ng.
Sử dụng pipet vô trùng chuyển 1ml n−ớc mẫu pha lo2ng vào giữa đĩa petri,
mỗi độ pha lo2ng cấy vào 2 đĩa. Môi tr−ờng thạch th−ờng để nguội 450C rót
vào đĩa chứa mẫu, xoay tròn đĩa theo chiều kim đồng hồ sau đó quay ng−ợc lại nhằm trộn đều môi tr−ờng với mẫu n−ớc kiểm tra. Để thạch đông tự nhiên,
lật úp đĩa petri chuyển vào tủ ấm 370C trong 24h.
Đếm số khuẩn lạc mọc trên mặt đĩa thạch. Để tránh nhẫm lẫn dùng bút chì kính kẻ chia đĩa thành nhiều phần và đếm theo thứ tự hoặc đ−a lên giá kính chia ô để đếm. Nếu v−ợt quá 300 khuẩn lạc/đĩa petri thì loại bỏ và mẫu cần pha lo2ng tiếp.
Đọc kết quả và tính theo công thức:
N: Số l−ợng vi
khuẩn trong 1ml n−ớc
A: Số khuẩn lạc trong 1ml n−ớc nguyên không pha lo2ng
B: Số khuẩn lạc trong 1ml n−ớc ở độ pha lo2ng 10-1
C: Số khuẩn lạc trong 1ml n−ớc ở độ pha lo2ng 10-2
D: Số khuẩn lạc trong 1ml n−ớc ở độ pha lo2ng 10-3
n: Đậm độ pha lo2ng
▪ Ph−ơng pháp xác định vi khuẩn E. coli:
- Ph−ơng pháp: lên men nhiều ống và tính kết quả số l−ợng E. coli bằng
cách tra bảng tìm số gần đúng MPN (Most Probable Number). - Chuẩn bị mẫu:
Mẫu pha lo2ng ở các đậm độ khác nhau 10-1, 10-2, 10-3,... tuỳ theo mức
sạch bẩn. Thông th−ờng một mẫu nuôi cấy ít nhất ở 3 đậm độ liên tiếp. - Nuôi cấy:
Mỗi đậm độ pha lo2ng phải nuôi cấy 5 ống môi tr−ờng canh thang CLP,
để tủ ấm 420C thời gian 24h. Sau đó các ống môi tr−ờng chuyển màu từ hồng
đỏ sang màu vàng và sinh hơi trong ống Durham thì ria cấy chuyển sang thạch
Endo để tủ ấm 420C, 24h.
Trên môi tr−ờng Endo khuẩn lạc xuất hiện màu ánh kim có thể xác định
là khuẩn lạc E. coli nguồn gốc từ phân. Để xác định chính xác dùng que cấy
vô trùng, chọn một khuẩn lạc điển hình đứng riêng rẽ cấy chuyển sang môi tr−ờng thạch máu để thuần nhất, sau đó chuyển chạy máy Vitek để định danh
N (VK/1ml) =
A + 10B + 100C + 1000D
vi khuẩn (tr−ờng hợp không có máy Vitek làm phản ứng IMVIC).
- Tính kết quả: ghi chép số liệu các ống d−ơng tính, tra bảng MPN tính số E. coli trong 100ml hoặc trong 1 lít n−ớc (coliindex).
▪ Ph−ơng pháp xác định Clostridium perfringens:
- Chuẩn bị mẫu: mẫu n−ớc đ−ợc đun cách thuỷ 75 - 800C trong 5 phút
để diệt tạp khuẩn.
- Tiến hành: mỗi mẫu xét nghiệm chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa 10ml môi tr−ờng thạch Winson Blair đ2 làm tan chảy thạch và giữ ở nhiệt độ 60°C, thêm
2 ml dung dịch Na2SO3 20%, 5 giọt dung dịch FeSO4 5% vô khuẩn. Tuỳ theo
dự tính mức sạch hay bẩn của mẫu n−ớc mà cấy 10ml, 5ml hay 1ml. Dùng pipet hút mẫu n−ớc rồi cấy tận xuống đáy ống môi tr−ờng. Cần tránh bọt khí, khi cấy bằng cách vừa thả mẫu vừa xoay nhẹ pipet và rút pipet lên dần. Trộn đều mẫu với môi tr−ờng, làm lạnh nhanh trong vòi n−ớc cho đông thạch tránh oxy xâm nhập trở lại môi tr−ờng. Một mẫu cần cấy 2 đậm độ khác nhau, sau nuôi cấy chuyển các ống nghiệm vào tủ ấm 37°C 24 - 48h lấy ra đọc kết quả.
Đếm tất cả các khuẩn lạc màu đen to bằng hạt đỗ xanh chính là khuẩn lạc Clostridium perfringens và tính trung bình số trực khuẩn/10ml mẫu n−ớc. * Ph−ơng pháp kiểm tra vi sinh vật trong không khí
áp dụng ph−ơng pháp lắng bụi của Koch để xác định tổng số vi sinh
vật hiếu khí.
Nguyên tắc: vi khuẩn trong không khí rơi xuống mặt đĩa thạch và phát triển thành khuẩn lạc (mỗi khuẩn lạc là một vi khuẩn), đếm số l−ợng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Theo công thức của V.Omealianski tính ra số l−ợng vi
sinh vật (X) có trong một m3 không khí:
X = K * S 100 * 100 * A
S : Diện tích của đĩa petri (cm2)
K: Hệ số t−ơng ứng với thời gian để đĩa (5' = 1, 10' = 2, 15' = 3)
100: Diện tích quy −ớc (số vi khuẩn trên 100 cm2 thạch để trong
thời gian 5' bằng tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 10 lít không khí).
100: Hệ số nhân để tính ra kết quả trong 1m3 không khí.
* Ph−ơng pháp xét nghiệm một số vi khuẩn ô nhiễm trong thịt
áp dụng ph−ơng pháp kỹ thuật xét nghiệm theo quy trình tiêu chuẩn
Việt Nam (TCVN), tham khảo một số quy trình của n−ớc ngoài. Các xét nghiệm đ−ợc thực hiện trên cơ sở trang thiết bị của Cơ quan Thú y vùng II, Cục Thú y.
▪ Lấy mẫu:
- Thịt và sản phẩm thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử, TCVN 4833 -
1: 2002 (ISO 3100 - 1: 1991).
- Thịt và sản phẩm thịt - Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử, TCVN 4833 -
2: 2002 (ISO 3100 - 2: 1988).
▪ Xác định vi khuẩn trong thịt:
- Ph−ơng pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí: TCVN 5667: 1992.
- Phương pháp phát hiện và ủếm sốE. coli: TCVN 4882: 2001.
- Phương pháp phát hiện và ủếm sốE. coli : TCVN 5155: 1990.
- Phương pháp phát hiện Salmonella: TCVN 5153:1990.
- Phương pháp phát hiện và ủếm sốSta. aureus: TCVN 5156: 1990.
- Phương pháp phát hiện, xác định Cl. perfringens: TCVN 4991: 1989.
▪ Ph−ơng pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu thịt:
Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí theo TCVN 5667 - 1992 [35]; lấy
- Nguyên lý: trên môi tr−ờng thạch th−ờng, ở điều kiện hiếu khí, nhiệt
độ 370C, thời gian sau 24h, mỗi khuẩn lạc phát triển riêng rẽ là một điểm xuất
phát của một vi khuẩn. Do vậy đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch chính là số vi khuẩn chứa trong mẫu phân tích.
- Chuẩn bị mẫu:
Cân 25g thịt (loại bỏ mỡ, gân, bạc nhạc) cho vào túi P.E chuyên dụng vô trùng, bổ sung thêm 225ml dung dịch đệm peptone. Đồng nhất mẫu 1 phút bằng
máy Stomacher. Hỗn dịch thu đ−ợc có tỷ lệ mẫu pha lo2ng 10- 1. Từ hỗn dịch
này có thể ph2 lo2ng mẫu 10- 2, 10- 3,... tuỳ theo mức độ đánh giá ô nhiễm để
xác định mức pha lo2ng. - Nuôi cấy:
Với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch riêng. Lấy 1ml hỗn dịch đồng nhất mẫu pha lo2ng ở những đậm độ khác nhau chuyển vào giữa đĩa petri. Môi tr−ờng thạch PCA
(Plate Count Agar) hòa tan, hấp vô khuẩn để nguội khoảng 450C, đổ vào từng
đĩa khoảng 12 - 15ml thạch, trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa 1 - 2 vòng theo kim đồng hồ và ng−ợc lại. Để đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng nằm
ngang. Sau đó, lật ng−ợc đĩa chuyển vào tủ ấm 370C, 24h đọc kết quả.
Tài liệu của Newzealand (1991) cho biết dùng kỹ thuật đổ đĩa sẽ làm tổn th−ơng vi khuẩn, nhất là đối với mẫu thịt đ−ợc bảo quản trong điều kiện nhiệt độ thấp. Vì thế, thịt đông lạnh có thể sử dụng ph−ơng pháp cấy láng trên thạch. Các đĩa thạch đ2 chuẩn bị tr−ớc (rót 12 - 15ml thạch vào hộp lồng, để nguội). Dùng pipét vô khuẩn hút 01ml hỗn dịch mẫu pha lo2ng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa đĩa thạch, dùng que gạt thuỷ tinh cấy láng cho tới khi mẫu đ−ợc phân bố đều trên mặt thạch.
- Tính kết quả:
nhất đ−a lên giá kính có chia ô, hoặc dùng bút chì kính kẻ ô trên mặt sau đĩa, thực hiện đếm theo thứ tự tránh nhầm lẫn. Chú y chọn đĩa có d−ới 300 khuẩn