3. Địa điểm, vật liệu, nội dung vμ ph−ơng pháp nghiên cứu
3.4.Ph−ơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Ph−ơng pháp điều tra ngoμi đồng
• Điều tra diễn biến bệnh
- Điều tra theo 5 điểm chéo góc với số l−ợng 3 -5 cây/ điểm, điều tra định kỳ 7 ngμy/ 1lần.
• Điều tra mức độ gây hại trên các giống
- Điều tra theo 5 điểm chéo góc với số l−ợng 5 cây/điểm, thời gian điều tra vμo tháng 6. Đo kích th−ớc vết bệnh với số l−ợng100 lá/giống (đo kích th−ớc vết bệnh đối với những giống có vết bệnh lớn).
+ Các chỉ tiêu nghiên cứu
• Tỷ lệ bệnh (TLB) %, [1] TLB (%) = a/ b x 100 Trong đó: a : lμ tổng số bộ phận có triệu chứng bệnh b : lμ tổng số bộ phận điều tra • Chỉ số bệnh (CSB) %, [1] CSB (%) = Σ 100 ) ( ) ( x NxT axb Trong đó:
a - Số l−ợng bộ phận điều tra bị bệnh của mỗi cấp bệnh t−ơng ứng b - Trị số cấp bệnh của mỗi cấp t−ơng ứng
N - Tổng số bộ phận điều tra T - Trị số cấp bệnh của cấp bệnh cao nhất • Chỉ tiêu phân cấp bệnh + Theo triệu chứng: - Cấp 1: < 5 % diện tích lá (quả) có vết bệnh - Cấp 3: 5 – 10 % diện tích lá (quả) có vết bệnh
- Cấp 5: > 10– 15 % diện tích lá (quả) có vết bệnh
- Cấp 4: > 15 – 20 % diện tích lá (quả) có vết bệnh
- Cấp 5: > 20 % diện tích lá (quả) có vết bệnh
3.4.2. Ph−ơng pháp lấy mẫu vμ bảo quản mẫu (Mondal S.N. vμ Timmer, L. W(2002 ))
Thu thập mẫu lá cây có múi bị bệnh đốm dầu điển hình (trên những cây ch−a phun thuốc trừ nấm), lμm khô mẫu lá ở nhiệt độ phòng ( 23 – 27 0C ) từ 2 – 3 ngμy, sau đó bảo quản mẫu lá cây có múi bị bệnh đốm dầu đã đ−ợc lμm khô vμo trong túi giấy đến khi sử dụng.
3.4.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu trong phòng
3.4.3.1 Ph−ơng pháp lμm ẩm mẫu lá bệnh
(Dựa theo ph−ơng pháp của Mondal S.N. vμ Timmer, L. W(2002 ))
Mẫu lá bệnh thu thập đã đ−ợc lμm khô ở nhiệt độ phòng (23 – 27 0C ), cắt ra thμnh từng mảnh có đ−ờng 2 x 2 cm2, ... hoặc để nguyên lá, sau đó lμm ẩm lá bằng 1 trong 2 cách sau:
+ Phun n−ớc hoặc ngâm trực tiếp lá vμo n−ớc
+ Lμm −ớt giấy thấm rồi đặt lá lên trên mặt giấy thấm đã đ−ợc lμm −ớt Thời gian mỗi lần lμm ẩm vμ số lần lμm ẩm (ngμy/tuần) tuỳ thuộc mục đích thí nghiệm. Sau khi lμm ẩm, mẫu lá đ−ợc lμm khô ở nhiệt độ phòng. Chu kỳ lμm ẩm – khô mẫu lá đ−ợc lặp lại cho đến khi hình thμnh quả thể.
3.4.3.2 Ph−ơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm
Cắt lá cây có múi bị bệnh đốm dầu thμnh những mảnh lá có kích th−ớc 2cm x 2cm, lμm ẩm lá theo ph−ơng pháp của Mondal S.N. vμ Timmer, L. W(2002 )). Lμm ẩm 5 ngμy/ tuần vμ 2 giờ/ngμy ở nhiệt độ phòng, thí nghiệm đ−ợc theo dõi hμng tuần. Đo kích th−ớc quả thể, túi bμo tử vμ bμo tử túi, 50 quả thể/mẫụ
3.4.3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu ảnh h−ởng của ẩm độ vμ nhiệt độ đến sự
hình thμnh quả thể nấm Mycosphaerellạ sp.
(Mondal S.N. vμ Timmer, L. W(2002 ))
+ Số lần lμm ẩm
Mẫu lá đ−ợc lμm ẩm với số lần khác nhau: 5 ngμy/tuần, 3 ngμy/tuần,
2 ngμy/tuần, 1 ngμy/tuần vμ thời gian lμm ẩm mỗi lần lμ 2 giờ/ngμy, so với đối chứng không đ−ợc lμm ẩm. Mỗi công thức đ−ợc lặp lại 3 lần. Chu kỳ lμm ẩm - khô mẫu lá cam Đ−ờng Canh bị bệnh đ−ợc lặp lại đến khi quả thể nấm
Mycosphaerella sp. hình thμnh. Theo dõi thí nghiệm hμng tuần.
+ Thời gian lμm ẩm
Mẫu lá đ−ợc lμm ẩm ở 4 ng−ỡng thời gian khác nhau: 10 phút/ ngμy, 30phút/ ngμy, 1giờ/ngμy, 2 giờ/ngμy, 3 giờ/ ngμy vμ với số lần lμm ẩm lμ 4 ngμy/tuần, so với đối chứng không đ−ợc lμm ẩm. Mỗi công thức đ−ợc lặp lại 3 lần. Chu kỳ lμm ẩm - khô mẫu lá cam Đ−ờng Canh bị bệnh đ−ợc lặp lại đến khi quả thể nấm
Mycosphaerella sp. hình thμnh. Theo dõi thí nghiệm hμng tuần.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Thời gian quả thể hình hμnh
+ Các giai đoạn phát triển của quả thể: non (quả thể chỉ chứa những sợi tơ bên hoặc chứa sợi tơ bên vμ túi bμo tử (Asci) còn non bên trong không chứa bμo tử túi (Ascospores)), chín (đã hình thμnh bμo tử túi), giμ (quả thể không chứa bμo tử túi, chứa những mảnh nhỏ).
+ Ph−ơng pháp đánh giá sự phân loại quả thể (%): dùng que khêu quả thể, mỗi mẫu tách 20 quả thể cho vμo giọt lactophenol trên lam kính, dùng lamen đặt lên trên vμ soi d−ới kính hiển vị
• Ph−ơng pháp nghiên cứu ảnh h−ởng của phân urê, vôi bột đến sự hình
thμnh quả thể nấm Mycosphaerella sp.
Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh h−ởng của phân urê, vôi bột vμ kết hợp vôi cùng với phân urê đến sự hình thμnh quả thể nấm Mycosphaerella sp. trên lá cam Đ−ờng Canh đ−ợc bố trí trong những thùng xốp có chiều dμi 30 cm, rộng 20 cm, sâu 10 cm, thêm đất vμo mỗi hộp dầy khoảng 5 -7 cm, mỗi công thức thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thêm n−ớc cho đất ẩm t−ơng tự nh− điều kiện ở ngoμi v−ờn câỵ 100 lá cam Đ−ờng Canh đã đ−ợc lμm khô ở nhiệt độ phòng, rải lên trên bề mặt đất mỗi công thức.
+ ảnh h−ởng của phân urê
Phân urê đ−ợc hoμ tan trong n−ớc, t−ới lên lá ở các công thức với l−ợng 30 g/m2, 40 g/m2, 50 g/m2, so sánh với công thức đối chứng. Mỗi công thức đ−ợc lặp lại 3 lần. Lá cam Đ−ờng Canh ở các công thức đ−ợc t−ới n−ớc 3 – 4 lần / tuần để tạo điêu kiện thích hợp cho quả thể nấm Mycosphaerella sp. phát triển. Thí nghiệm đ−ợc theo dõi hμng tuần.
+ ảnh h−ởng của vôi bột
Vôi bột đ−ợc rắc lên trên lá với l−ợng 200 g/m2, 250 g/m2, 300 g/m2, so sánh với công thức đối chứng. Mỗi công thức đ−ợc lặp lại 3 lần. Lá cam Đ−ờng Canh ở các công thức đ−ợc t−ới n−ớc 3 – 4 lần / tuần để tạo điêu kiện thích hợp cho quả thể nấm Mycosphaerella sp. phát triển. Thí nghiệm đ−ợc theo dõi hμng tuần.
+ ảnh h−ởng kết hợp của phân urê vμ vôi bột
Phân urê + vôi bột đ−ợc xử lý kết hợp ở các công thức với l−ợng
30 g/m2 + 200 g/m2, 40 g/m2 + 250 g/m2, 50 g/m2 + 300 g/m2, so sánh với công thức đối chứng. Mỗi công thức đ−ợc lặp lại 3 lần. Lá cam Đ−ờng Canh ở các công thức đ−ợc t−ới n−ớc 3 – 4 lần / tuần để tạo điều kiện thích hợp cho quả thể nấm Mycosphaerella sp. phát triển. Thí nghiệm đ−ợc theo dõi hμng tuần.
+ Các giai đoạn phát triển của quả thể: non (quả thể chỉ chứa những sợi tơ bên hoặc chứa sợi tơ bên vμ túi bμo tử (Asci) còn non bên trong không chứa bμo tử túi (Ascospores)), chín (đã hình thμnh bμo tử túi), giμ (quả thể không chứa bμo tử túi, chứa những mảnh nhỏ).
+ Ph−ơng pháp đánh giá sự phân loại quả thể (%): dùng que khêu quả thể, mỗi mẫu tách 20 quả thể cho vμo giọt lactophenol trên lam kính, dùng lamen đặt lên trên vμ soi d−ới kính hiển vị
+ Sự phân huỷ của lá (Mondal S. N. vμ Timmer (2003) Cấp 0: lá không bị phân huỷ, lá vẫn có độ chắc chắn
Cấp 1: lá bị phân huỷ một phần nhỏ, lá mềm dẻo, hầu nh− vẫn còn nguyên Cấp 2: lá bị phân huỷ không nhiều, một số chỗ trên lá bị phân huỷ thμnh mμng mỏng
Cấp 3: lá bị phân huỷ nặng, trơ gân lá + Mật độ quả thể - Cấp 0 : không có quả thể - Cấp 1 : 1 - 5 % diện tích lá có quả thể - Cấp 2 : 6 - 10 % diện tích lá có quả thể - Cấp 3 : 11 - 15 % diện tích lá có quả thể - Cấp 4 : 16 - 20 % diện tích lá có quả thể - Cấp 5 : 21 - 26 % diện tích lá có quả thể - Cấp 6 : 26 - 30 % diện tích lá có quả thể - Cấp 7 : 31 - 35 % diện tích lá có quả thể - Cấp 8 : 36 - 40 % diện tích lá có quả thể - Cấp 9 : 41 - 45 % diện tích lá có quả thể - Cấp 10: >50% diện tích lá có quả thể