Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống bông ựã ựược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu.
Theo Liu và cs, 2000 [55] sử dụng 65 cặp mồi ựể khuếch ựại 70 locus trong genome (nhiễm sắc thể) của các loài bông. Kết quả nghiên cứu chỉ thị SSR ựược xác ựịnh trong nghiên cứu này ựã cung cấp những số liệu có mức ựộ tin cậy cao là cơ sở cho các nghiên cứu khác. Hơn nữa, có thể sử dụng kết hợp chỉ thị SSR với các chỉ thị khác ựể lập bản ựồ liên kết của genome bông. Thật vậy, gần ựây bản ựồ liên kết ựã ựược tạo ra với sự kết hợp sản phẩm của 199 RAPD và SSR trong chọn lọc giống bông (Ulloa và cs, 2000) [76].
Một số nghiên cứu gần ựây khi sử dụng các chỉ thị như RAPD (random amplified polymorphic DNA), AFLP (amplified fragment length polymorphism) và SSR cho thấy mức ựộ ựa hình của các loài bông trồng tương ựối thấp, có thể từ 1 - 3% (Wendel và cs, 1992; Tatineni và cs, 1996; Pilley và Myers, 1999; Lu và Myers, 2002) [80], [73], [66], [58] và 1 - 8% (Multani và Lyon, 1995) [62]. Một số kết quả ở Úc, Trung Quốc và Pakistan cũng có kết quả tương tự (Zuo và cs, 2000; Rahman và cs, 2002) [82] [67]. Tuy nhiên, một số kết quả khác cho thấy mức ựộ ựa hình của các giống bông khá cao. M. K. Rana và K. V. Bhat, 2005 [69] nghiên cứu
59 giống bông thuộc 4 loài bông trồng cho thấy, ựa hình giữa 59 giống bông ựạt 36%. Trong ựó, mức ựộ tương ựồng di truyền trung bình của 41 giống bông luồi (Gossypium hirsutum) ựạt 74%, ựồng thời qua nghiên cứu các tác giả ựã khẳng ựịnh rằng ựa hình giữa các loài nhị bội cao hơn các loài bông tứ bội.
Trước ựó, Rahman và cs, 2002 [68] nghiên cứu ựa hình của 27 giống bông cho tương ựồng là 66,2%. Sử dụng ựồng thời chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử Tatineni và cs, 1996 [73] ựã ựánh giá quan hệ di truyền của 16 giống bông nhập nội, khẳng ựịnh tương quan tuyến tắnh dương (r=0,63) giữa khoảng cách di truyền theo chỉ thị RAPD và khoảng cách phân loại theo chỉ thị hình thái. Trong khi ựó, Ivan Schuster và cs, 2006 [47] sử dụng microsatellites nghiên cứu quan hệ di truyền của 53 giống bông, cho kết quả tương quan tuyến tắnh trung bình ựạt 0,40 ổ 0,01. Một số nghiên cứu khác, Iqbal và cs, 1997 [46] xác ựịnh tỷ lệ ựa hình 89,1% trong 22 giống bông Luồi; trong ựó, 17 giống phân vào cùng nhóm có tỷ lệ ựồng dạng di truyền 81,5 - 93,4%; chỉ có riêng giống nhị bội mức tương ựồng thấp (55,7%) so với các giống tứ bội. đối với hai loài bông cỏ châu Phi (G. herbaceum) và bông cỏ châu Á (G. arboreum), mức ựộ tương ựồng ựạt 72% ghi nhận trong một nghiên cứu khác (Rana và cs., 2002) [68].
Trong những năm gần ựây, chỉ thị SSR ựược sử dụng khá phổ biến ựể ựánh giá ựa hình và lập bản ựồ gen. Jinfa Zhang và cs, 2005 [50] ựã sử dụng 88 cặp mồi SSR nghiên cứu ựa hình của 24 giống có nguồn gốc khác nhau ựã thu ựược 177 allen với tương ựồng di truyền dao ựộng từ 0,694 ựến 0,936 (trung bình 0,772).
Ngày nay, nhiều nhà khoa học trên thế giới ựã ứng dụng kết hợp nhiều chỉ thị phân tử ựể ựánh giá ựa hình bông. Sử dụng chỉ thị RAPD, SSR, EST, AFLP và kết hợp các chỉ thị ựể ựánh giá 11 giống bông (Luồi và Hải ựảo) cho mức ựộ tương ựồng di truyền dao ựộng tương ứng là 63,8 - 95,9%, 13,8 - 98,1%, 70,4 - 98,5%, 13,7 - 99,3% và 78,2 - 98,0%; 11 giống bông ựược phân thành 2 nhóm chắnh (1 nhóm có 8 giống gồm cả bông Luồi và Hải ựảo, nhóm còn lại gồm 3 nhóm bông Luồi) (Ebtissam. H. A. Hussein và cs, 2007) [44]. Tương tự, Hussein và cs, 2002
[42] sử dụng kết hợp các chỉ thị RAPD, SSR, ISSR, AFLP phân tắch 13 giống bông và ựã chứng minh rằng giống bông Luồi (Hindi) ựược tách ra từ các giống bông Hải ựảo ở Ai Cập. Trong khi ựó, Samina N. Qureshi và cs, 2004 [70] sử dụng chỉ thị EST-SSR nghiên cứu ựa hình giữa các loài bông cho thấy ựa hình giữa các giống cùng loài bông Luồi (Gossypium hirsutum L.) là 26%, giữa loài bông Luồi và bông Hải ựảo (Gossypium barbadense L.) là 52%.
Tương tự, Wang và cộng sự, 2004 [79] ựánh giá ựa hình của 50 giống bông trồng dựa vào chỉ thị EST-SSR, tương quan tuyến tắnh giữa các giống từ 0,11 ựến 0,83 (trung bình 0,47); các giống phân thành hai nhóm chắnh và hầu hết ựều phù hợp với phả hệ của các giống bông (nguồn gốc các giống bông). điều ựó ựã chứng minh rằng, chỉ thị EST-SSR là công cụ hữu hiệu ựể phân tắch, ựánh giá ựa hình bông.
Sử dụng kết hợp các chỉ thị RAPD, ISSR, SSR. Hussein và cs, 2006 [43] ựã ựánh giá 21 giống bông cho kết quả về tương ựồng di truyền tương ứng là 72,1 - 95,7%; 79,1 - 95,0% và 72,1 - 96,6%. Trước ựó, các nhà khoa học Trung Quốc ựã nghiên cứu tương quan di truyền của 36 giống bông sử dụng các chỉ thị SSR, ISSR và RAPD thu ựược mức tương ựồng di truyền của các giống nghiên cứu dao ựộng từ 57,5 - 92,9%. Phân tắch sơ ựồ hình cây cho thấy, sử dụng chỉ thị RAPD cho kết quả thành hai nhóm chắnh, nhóm 1 gồm tất cả các giống thuộc loài bông Hải ựảo ngoại trừ giống PEA (Pima Early American). Tuy nhiên, chỉ thị ISSR và SSR cho kết quả là hai nhóm chắnh nhưng nhóm 1 gồm các giống bông Hải ựảo và nhóm 2 gồm các giống bông luồi và giống PEA. Mặc dù kết quả phân tắch hình cây có những khác nhau giữa các chỉ thị nhưng phần lớn vẫn tương ựồng với nhau. Những khác nhau ựó có thể là do ảnh hưởng của môi trường của các loài bông hoặc do sự tiến hoá cơ học (Hussein và cs, 2002) [42].
Tóm lại, sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng ựược nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi. Nhiều giống cây trồng với các tắnh trạng khác nhau ựã ựược tạo ra, cơ bản ựáp ứng ựược nhu cầu sản xuất. đối với cây bông, việc ứng dụng chỉ thị phân tử ựánh giá ựa hình ựược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên
cứu và ựạt ựược nhiều kết quả ựáng tin cậy. Tuy nhiên trong một số nghiên cứu kết quả thu ựược ựã có sự khác nhau nhưng phần lớn các nhà nghiên cứu ựều cho rằng tương ựồng di truyền ựối với các giống bông Luồi tương ựối cao (0,70 - 0,93), ựa hình của loài nhị bội cao hơn tứ bội.
Ở Việt Nam, việc chọn tạo giống bông ựã ựược nghiên cứu từ rất lâu nhưng chủ yếu dựa vào các ựặc ựiểm hình thái (di truyền số lượng). Việc ứng dụng công nghệ sinh học mới ựược quan tâm và bắt ựầu nghiên cứu trong những năm gần ựây theo các hướng như chuyển gen kháng sâu, kháng hạn cho bông, sử dụng các chỉ thị phân tử ựể kiểm tra, ựánh giá sự biểu hiện của gen... Tuy nhiên, kết quả chỉ ở mức ựộ trong phòng thắ nghiệm.
Xuất phát từ thực tế ựó, ựể giải quyết những ựòi hỏi cấp bách về công tác chọn tạo giống bông, ngoài việc sử dụng các phương pháp chọn lọc truyền thống cần tăng cường kết hợp với việc ứng dụng các chỉ thị phân tử ựể nhanh chóng tạo ra các giống mới phù hợp với nhu cầu sản xuất.
Phần 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Giống bông: Gồm 50 mẫu giống bông Luồi có nguồn gốc khác nhau. Danh sách cụ thể như sau: sách cụ thể như sau:
TT Ký hiệu Mẫu giống Nguồn gốc TT Ký hiệu Mẫu giống Nguồn gốc 1 G1 22 Liên Xô 26 G26 1530 Trung Quốc 2 G2 37 Liên Xô 27 G27 1539 Trung Quốc 3 G3 524 Mỹ 28 G28 1562 Trung Quốc 4 G4 548 Etiopia 29 G29 1585 Trung Quốc 5 G5 1247 Ấn độ 30 G30 1592 Trung Quốc 6 G6 1272 Mỹ 31 G31 1642 Trung Quốc 7 G7 1306 Zimbabue 32 G32 1646 Trung Quốc 8 G8 1308 Zimbabue 33 G33 1652 Trung Quốc 9 G9 1328 Ấn độ 34 G34 1671 Trung Quốc 10 G10 1350 Trung Quốc 35 G35 TL00-34 Việt Nam 11 G11 1356 Nam Mỹ 36 G36 TL00-35 Việt Nam 12 G12 1360 Thái Lan 37 G37 VN36P Việt Nam 13 G13 1392 Indonesia 38 G38 KS02-63 Việt Nam 14 G14 1405 Pháp 39 G39 8-2-4-A2 Việt Nam 15 G15 1410 Pháp 40 G40 8-2-4-A3 Việt Nam 16 G16 1414 Pháp 41 G41 BO4-4-2 Trung Quốc 17 G17 1416 Pháp 42 G42 BO3-5-4 Trung Quốc 18 G18 1422 Pháp 43 G43 Au01 Australia 19 G19 1428 Pháp 44 G44 G2GTQ Trung Quốc 20 G20 1429 Pháp 45 G45 Bollgard II Mỹ
21 G21 1438 Thái Lan 46 G46 D20-20 Trung Quốc 22 G22 1441 Thái Lan 47 G47 D97-6 Trung Quốc 23 G23 1478 Thái Lan 48 G48 D99-4 Trung Quốc 24 G24 1480 Thái Lan 49 G49 TM1KS Trung Quốc 25 G25 1483 Thái Lan 50 G50 5-3-1 Việt Nam
3.1.2. Mồi (primers) và các vật tư khác
- Sử dụng 20 cặp mồi cho chỉ thị SSR ựược chọn lọc từ tổ hợp 60 cặp mồi sử dụng ựể ựánh giá ựa hình ADN (phụ lục 2).
3.2. Thời gian nghiên cứu
Các thắ nghiệm của ựề tài ựược tiến hành từ tháng 11/2009 ựến tháng 5/2011 trong các vụ đông Xuân (bắt ựầu từ tháng 11 - 12 năm trước, kết thúc vào tháng 4 - 5 năm sau) và Hè Thu (bắt ựầu từ tháng 6 - 7, kết thúc vào tháng 11 - 12). đây là các vụ trồng bông chắnh tại Ninh Thuận.
3.3. địa ựiểm nghiên cứu
Toàn bộ các thắ nghiệm ựược bố trắ tại Nha Hố, Nhơn Sơn, Ninh Sơn, Ninh Thuận. Trong ựó:
- Các thắ nghiệm tách chiết ADN và ựánh giá ựa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR ựược tiến hành tại phòng thắ nghiệm Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học của Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển nông nghiệp Nha Hố.
- Các thắ nghiệm: Tạo các tổ hợp lai; ựánh giá khả năng kết hợp và ưu thế lai của các giống bố mẹ ựược tiến hành trên các khu ựất thắ nghiệm của Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển nông nghiệp Nha Hố.
3.4. Nội dung nghiên cứu
- đánh giá ựa dạng di truyền của bố mẹ theo các chỉ thị hình thái.
- đánh giá ựa dạng di truyền của các giống bố mẹ theo các chỉ thị phân tử SSR. - Phân nhóm bố mẹ, lập sơ ựồ lai, tạo hạt lai theo kiểu lai ựỉnh (4 x 6 tổ hợp + 10 bố mẹ).
- đánh giá khả năng kết hợp của bố mẹ và ưu thế lai của các tổ hợp lai tạo theo sơ ựồ lai ựỉnh (4 x 6 tổ hợp + 10 bố mẹ).
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. đánh giá các ựặc ựiểm hình thái của các giống bố mẹ
- Công thức: 50 mẫu giống bông.
- Phương pháp bố trắ: Các mẫu giống bông ựược bố trắ tuần tự không lặp lại; khoảng cách gieo 0,9m x 0,25m x 1cây/hốc; Diện tắch ô: 5,4 m2/bố mẹ.
3.5.2. đánh giá ựa dạng di truyền của các giống bố mẹ theo các chỉ thị phân tử SSR
3.5.2.1. Chuẩn bị mẫu, tách chiết ADN
- Chuẩn bị mẫu lá bông: mẫu lá của các giống bông ựược thu từ những cây ựược treo biển ựánh dấu cho vào ống eppendorf 2ml, sau ựó nhanh chóng cho vào nitơ lỏng. Mẫu lá ựược dùng ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ -850C.
- Tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB.
- định lượng ADN tổng số, ADN pha loãng, chuẩn hóa nồng ựộ ADN trên agarose 1,0% và trên máy quang phổ UV/vis
3.5.2.2. Phương pháp PCR-SSR
- Phản ứng PCR ựược thực hiện trên máy PCR iCycler, với thể tắch phản ứng 15ộl, trong ựó chứa các thành phần phản ứng là H2O, 1X PCR buffer, 2,5mM MgCl2, 100ộM dNTPs, 25pM mồi/1 mồi, 25 - 50 ng ADN tổng số và 0,5 - 1U Taq ADN polymerase.
- Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR-SSR (1) 950C trong 7 phút, (2) 940C trong 30 giây, (3) 50 - 600C trong 1 phút, (4) 720C trong 1 phút, (5) các bước từ 2 ựến 4 ựược lặp lại là 35 chu kỳ, (6) 720C trong 5 phút, (7) giữ lạnh ở 40C.
- điện di sản phẩm PCR trên agarose 3% ở 100V trong 3 giờ. Nhuộm gel trong Ethidium Bromide 0,5ộg/ml 15 phút và soi dưới ựèn UV, chụp ảnh.
3.5.3. Tạo các tổ hợp lai cho ựánh giá khả năng kết hợp và ưu thế lai theo kiểu lai ựỉnh (top cross) lai ựỉnh (top cross)
- Số cặp lai: 24 cặp lai (bao gồm 4 giống mẹ và 6 giống bố)
- Phương pháp bố trắ: các bố mẹ ựược bố trắ tuần tự theo sơ ựồ lai, khoảng cách gieo 0,9m x 0,25m x 1cây/hốc; diện tắch ô: 5,4 m2/bố mẹ.
3.5.4. đánh giá khả năng kết hợp và ưu thế lai của các tổ hợp lai với các khoảng cách di truyền khác nhau cách di truyền khác nhau
- Công thức: 24 con lai và 10 bố mẹ.
- Phương pháp bố trắ: khối ựầy ựủ ngẫu nhiên RCBD, nhắc lại 3 lần; khoảng cách 0,9m x 0,25m x 1 cây; mật ựộ: 4,5 vạn cây/ha. Diện tắch ô 5,4 m2/công thức.
3.6. Kỹ thuật canh tác và BVTV
- Lượng phân bón: 120N, 60P2O5 và 60K2O (kg/ha).
- Các biện pháp chăm sóc và BVTV theo quy trình chung của Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển nông nghiệp Nha Hố.
3.7. Chỉ tiêu theo dõi
3.7.1. Theo dõi chỉ tiêu trong phòng
- Chất lượng và nồng ựộ ADN tổng số.
- Số phân ựoạn ADN trên mỗi mồi và tổng số phân ựoạn.
- Hệ số tương ựồng di truyền của bố mẹ theo chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử SSR).
3.7.2. Theo dõi chỉ tiêu ngoài ựồng
3.7.2.1. Thời gian sinh trưởng
Thời gian nở hoa (số ngày từ gieo ựến 50% số cây có hoa ựầu tiên nở), thời gian nở quả (số ngày từ gieo ựến 50% số cây có quả ựầu tiên nở).
Theo dõi toàn bộ số cây/công thức/lần lặp.
3.7.2.2. đặc ựiểm hình thái
- Dạng hình cây; - Thân: màu sắc thân;
- Cành: dạng cành, số cành ựực/cây và cành quả/cây (10 cây/công thức); - Lá: dạng lá, kắch thước lá, màu sắc lá, ựộ lông/lá, tuyến mật và tuyến gossypol;
- Quả: dạng quả, khối lượng quả và khối lượng 100 hạt; - Hoa: ựốm cánh hoa, màu sắc cánh hoa, màu hạt phấn; - Chiều cao cây (cm);
- Số cành quả/cây; - Số cành ựực/cây.
- Chiều dài cành quả trung bình. - Vị trắ cành quả 1.
đối với các chỉ tiêu chiều cao cây, số cành quả/cây và số cành ựực/cây, chiều dài cành quả trung bình và vị trắ cành quả 1 theo dõi 10 cây/công thức/lần lặp (trừ những cây ựầu hàng); các chỉ tiêu còn lại theo dõi trên toàn bộ hàng; ựánh giá tại giai ựoạn 50% số cây có quả ựầu tiên nở.
3.7.2.3. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất
- Số quả/cây, số quả/m2, khối lượng quả, khối lượng 100 hạt và tỷ lệ xơ. - Năng suất lý thuyết, năng suất thực thu, năng suất bông xơ.
Theo dõi toàn bộ số cây/công thức/lần lặp.
3.7.2.4. Chất lượng xơ bông
Cách thu mẫu bông hạt ựể phân tắch: thu 30 quả/công thức/lần lặp (thu quả ở vị trắ thứ 1 và thứ 2 trên cành quả thứ 4 - 6; chọn quả nở ựều, xơ trắng, không bị dắnh mưa và bị sâu bệnh hại) và phân tắch trên máy HVI.
3.7.2.5. Tình hình sâu bệnh hại
- Sâu xanh ựục quả: mật ựộ trứng và mật ựộ sâu (ựiều tra 3 ựịnh kỳ bắt ựầu tại thời ựiểm áp lực sâu xanh cao).
- Rầy xanh: đánh giá cấp rầy tại 2 giai ựoạn 70 ngày và 90 ngày sau gieo (trước khi xử lý thuốc trừ rầy)
- Bệnh phấn trắng: xác ựịnh tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh vào giai ựoạn 90 ngày sau gieo.
3.8. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
- Các chỉ tiêu về hình thái thu thập theo phương pháp IPGRI và quy phạm khảo nghiệm DUS của ngành bông. Số liệu thu thập ựược xử lý bằng phần mềm Excel và MSTATC.
- Số liệu về sự xuất hiện của các băng ựiện di theo quy ước có xuất hiện băng (1) và không xuất hiện băng (0) sau ựó ựược xử lý trên phần mềm Excel và NTSYS pc version 2.1.
+ Mô hình toán hình chung:
Yijk = ộ + di + cj + sij + eijk
Trong ựó: - Yijk là ựộ lớn tắnh trạng con lai của cặp ixj ở lần lặp thứ k