L ịch sử phát hiệ n
2. Đối với insulin: chuỗi A, B
2.3.5. Phương pháp phân tích và nhận dạng protein bằng khối phổ
Phương pháp sắc ký lỏng nhiều chiều kết hợp với khối phổ được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu các mẫu protein phức tạp. Các mẫu protein phức tạp như hệ huyết thanh, hệ protein của vi khuẩn…trước khi phân tích thường được làm giảm mức độ phức tạp bằng cách điện di 1 chiều hoặc 2 chiều. Sau khi điện di trên gel polyacrylamide, các băng protein quan tâm được cắt thu lại. Xử lý mẫu qua một loạt các khâu trung gian như khử bằng DTT loại bỏ cầu disulfide, alkyl hóa bằng IAA giúp quá trình thủy phân diễn ra triệt để, thủy phân bằng enzyme trypsin theo tỷ lệ cơ chất : trypsin là 50 : 1 ở 37oC trong 16 giờ. Hỗn hợp peptide sau khi thủy phân bởi enzyme được làm khô và hòa lại trong FA đến nồng độ cuối cùng là 0,1% để ngừng phản ứng. Hỗn hợp này tiếp tục được chạy qua sắc ký lỏng nano LC hai chiều tạo thành 16 phân đoạn khác nhau và được đưa trực tiếp vào nguồn nanoESI bằng kim phun và đi vào bộ phận phân tích khối. Trong nguồn nanoESI, nhờ tác dụng của một điện áp cao khoảng 2300V, các peptide được ion hóa và phun thành các giọt nhỏ điện tích (charge droplet), cùng với sự hỗ trợ của màn khí nitrogen (curtain gas) các ion peptide sẽ tách khỏi các phân tử dung môi và đi vào bộ phận phân tích khối của máy khối phổ QSTAR XL. Nhờ sự hỗ trợ của phần mềm điều khiển hệ thống khối khổ sẽ tự động quét phổ TOP MS và MS/MS của các ion peptide này. Nhờ
phần mềm tìm kiếm Mascot v1.8, phổ TOP MS và MS/MS của các mảnh peptide sẽ được nhận dạng.