L ịch sử phát hiệ n
2. Đối với insulin: chuỗi A, B
2.3.2. Tạo plasmid tái tổ hợp
2.3.2.1 Phản ứng cắt-nối gen bằng enzyme giới hạn NcoI và BamHI
Plasmid tái tổ hợp pET14bInsA(B) có chứa gen mã hóa cho chuỗi A (B) sẽ được xử lý lần lượt bằng hai enzyme giới hạn NcoI và BamHI với đệm thích hợp. Phản ứng được thực hiện ở 37oC trong khoảng thời gian 3h. Sản phẩm thu được được điện di trên gel agarose 1,5%. Sau đó bản gel được nhuộm với Ethidium bromide (0,5 µg/ml) và soi dưới đèn tử ngoại. Do liên kết giữa các base nitơ nên các băng ADN sẽ phát sáng và dễ dàng quan sát được. Sử dụng kít thôi gel QIAGEN thu lại băng ADN mã hóa cho chuỗi A (B). Vector pET32c của hãng Novagen có chứa sẵn điểm cắt của hai enzyme cũng được xử lý tương tự để thu lại vector pET32c mở vòng. Các sản phẩm thôi gel tiếp tục được sử dụng cho phản ứng nối ghép (ligation).
2.3.2.2 Phản ứng ligation
Phản ứng ligation nhằm mục đích đưa đoạn ADN có chứa gen mã hóa cho chuỗi A (B) vào vector biểu hiện pET32c. Phản ứng được thực hiện ở 22oC trong khoảng thời gian 16h với sự có mặt của enzyme nối T4 ligase, đoạn ADN mã hóa cho chuỗi A (B) và vector pET32c đã mở vòng. Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α và được tách chiết plasmid theo phương pháp của Sambrook và cộng sự [52].
2.3.2.3 Phản ứng cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme NdeI
Kết quả biến nạp sẽ được kiểm tra lại bằng phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn NdeI, khẳng định đoạn gen mong muốn đã được đưa vào vector chưa. Các plasmid tái tổ hợp thu được tiếp tục được kiểm tra bằng cách xử lý với enzyme này trong môi trường đệm thích hợp ở 37oC qua đêm. Sau đó sản phẩm phản ứng được điện di trên gel agarose 1,5%. Điện di đồ sẽ phản ánh hiệu suất của phản ứng ligation. Nếu đoạn gen được đưa vào pET32c thành công thì sẽ làm tăng thêm một điểm cắt của NdeI, có nghĩa là nâng ví trí cắt cho enzyme này từ 2 lên thành 3 vị trí. Phản ứng cắt đặc hiệu khi cho ra 3 băng ADN có kích thước khác nhau.