ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. Địa điểm nghiên cứu
- Trung tâm nghiên cứu Bò và Đồng cỏ Ba Vì và vùng phụ cận.
- Bộ môn Giải phẫu – Tổ chức phôi thai khoa Thú y - Tr−ờng đại học Nông nghiệp Hà Nội.
- Công ty TNHH công nghệ và xét nghiệm y học - MEDLATEC - 42- 44 Nghĩa Dũng - Ba Đình - Hà Nội.
3.2. Đối t−ợng nghiên cứu
- Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên đàn bê HF. Giống bê này một phần thuộc Trung tâm nghiên cứu bò và đồng cỏ Ba Vì, một phần là bò t− của các hộ gia đình.
Hostein Friesian (HF) - bò cao sản Hà Lan - Bê nghiên cứu từ sơ sinh đến 12 tháng tuổi 3.3. Nội dung nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các nội dung sau:
3.3.1 Điều tra theo dõi tình hình chăn nuôi và cơ cấu đàn bò sữa nuôi tại Trung tâm và vùng phụ cận
+ Cơ cấu đàn bò sữa của Trung tâm và vùng phụ cận từ năm 2005 đến tháng 6 năm 2008
+ Dịch bệnh của đàn bò sữa của Trung tâm và vùng phụ cận từ năm 2005 đến tháng 6 năm 2008
+ Tình hình hội chứng tiêu chảy trên đàn bê nuôi tại Trung tâm và vùng phụ cận từ tháng 10 năm 2007 đến tháng 6 năm 2008
3.3.2. Kiểm tra một số chỉ tiêu lâm sàng của bê bị viêm ruột ỉa chảy + Tần số hô hấp (lần/phút)
+ Tần số tim (lần/phút)
3.3.3. Kiểm tra một số chỉ tiêu sinh lý máu ở bê viêm ruột ỉa chảy - Các chỉ tiêu về hệ hồng cầu
+ Số l−ợng hồng cầu (triệu/mm3) + Hàm l−ợng Hemoglobin (g%) + Tỉ khối huyết cầu (%)
+ Nồng độ huyết sắc tố trung bình của hồng cầu (g%) + L−ợng huyết sắc tố trung bình của hồng cầu (ηg) + Chỉ số tròn của hồng cầu (Is)
+ Thể tích trung bình của hồng cầu (àm3) + Bề dày của hồng cầu (àm)
+ Diện tích trung bình của hồng cầu (àm2) + Sức kháng của hồng cầu (%)
+ Tốc độ lắng máu (mm/phút) + Thời gian đông máu (phút) - Các chỉ tiêu về hệ bạch cầu: + Số l−ợng bạch cầu (nghìn/mm3) + Công thức bạch cầu (%)
+ Thế nhân và h−ớng máu
4.3.4.Một số chỉ tiêu sinh hoá máu của bê bị tiêu chảy + Protein tổng số
+ Tỉ lệ Albumin trong huyết thanh (%) + Tỉ lệ Globulin trong huyết thanh (%)
+ Hoạt độ của các men GOT và GPT trong huyết thanh
+ Độ dự trữ kiềm (mg%) và hàm l−ợng đ−ờng huyết trong máu (mg%) 3.3.5. Một số biện pháp phòng và trị bệnh
3.4. Ph−ơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Xác định bê bệnh
+ Dựa vào triệu chứng lâm sàng
- Con vật ăn uống thất th−ờng, mệt mỏi, ủ rũ, sốt cao, v3 mồ hôi, mạch nhanh, run rẩy, khát n−ớc.
- Con vật ỉa chảy m3nh liệt, phân lỏng nh− n−ớc, màu đen thối khắm có khi lẫn cả máu t−ơi, những mảnh thức ăn ch−a tiêu hoá, phân dính vào hậu môn, kheo, đuôi và chân. Con vật đi ỉa nhiều lần trong ngày.
- Gia súc ỉa chảy lâu ngày thì bụng hóp, mắt trũng, lông xù, da khô mất tính đàn hồi.
+ Xác định một số loại vi khuẩn gây bệnh chủ yếu
Mẫu phân đ−ợc lấy trực tiếp từ hậu môn bê hoặc ngay khi bê thải ra, bảo quản trong môi tr−ờng 4 - 80C, sau đó, vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm trong điều kiện lạnh.
Các Ph−ơng pháp nuôi cấy và giám định đ−ợc thực hiện theo quy trình nghiên cứu th−ờng quy của Carter G.R, 1995 [48]; FAO, 1994 [8].
3.4.2 Một số chỉ tiêu lâm sàng
+ Tần số hô hấp (lần/phút): Đếm tần số hô hấp bằng cách quan sát nhịp thở ở thành ngực, đếm 3 lần sau đó lấy trung bình
+ Thân nhiệt (0C): Dùng nhiệt kế lấy thân nhiệt ở trực tràng, đo 3 lần sau đó lấy trung bình
+ Tần số tim (lần/phút): dùng ống nghe đếm số lần tim đập trong 1 phút, đếm 3 lần sau đó lấy trung bình
3.4.3 Một số chỉ tiêu sinh lý máu - Các chỉ tiêu về hệ hồng cầu
+ Số l−ợng hồng cầu (triệu/mm3 máu) + Hàm l−ợng Hemoglobin (g%) + Tỷ khối huyết cầu (%)
Các chỉ tiêu này đ−ợc xác định bằng máy Screen 18
+ Nồng độ huyết sắc tố trung bình của hồng cầu (g%)
Nồng độ huyết sắc tố trung bình của hồng cầu cầu là số huyết sắc tố có trong 100mlkhối hồng cầu đ3 nén chặt. Đơn vị tính 1à g%.
Công thức tính: NĐHSTTB = [Hb (g%) x 100/Tỷ khối huyết cầu Nồng độ này không bao giờ v−ợt quá 34g/100ml.
+ L−ợng huyết sắc tố trung bình của hồng cầu (ng)
Là l−ợng huyết sắc tố bình quân chứa trong một hồng cầu. Kết quả tính theo công thức: LHSTTB = [ Hb (%)x 10] /số l−ợng hồng cầu (triệu/mm3)
Đơn vị tính là: nanogam (ng) (1g=1012 ng) + Tốc độ lắng máu (lắng hồng cầu)
Theo Panchenkov và Wartman (1946), thì nguyên lý máu đ−ợc chống đông bằng dung dịch Xitrat natri 3,8% để yên, các hồng cầu sẽ rơi xuống, sau đó đến bạch cầu, bên trên 1à huyết t−ơng chứa đựng tiểu cầu. Tốc độ lắng hồng cầu đ−ợc đo bằng nghiên cứu độ rơi tự do của hồng cầu trong một cột máu của ống Panchenkov hoặc ống ly tâm Wintrobe có chia vạch đến 100 mm đ3 đ−ợc chống đông trên giá Panchenkov ở nhiệt độ phòng. Sau các mốc thời gian là 15, 30 và 45 phút thì đọc kết quả. Tốc độ lắng của hồng cầu là tỷ số giữa chiều cao của cột máu đọc đ−ợc với thời gian tại điểm đọc. Đơn vị tính : mm/phút.
+ Thời gian đông máu (phút)
Dùng một phiến kính khô sạch, không mỡ rồi nhỏ lên một giọt máu t−ơi. Lấy sợi tóc kéo ngang qua giọt máu, thấy keo sợi (giọt máu dính do đông máu làm sợi tóc bám vào) thì đọc kết quả bằng đồng hồ bấm giây.
+ Thể tích trung bình của hồng cầu (àm3)
V-tbhc = Tỷ khối huyết cầu x 10/Số hồng cầu (triệu/mm3máu)
+ Chỉ số tròn của hồng cầu (Is): Là tỷ lệ giữa đ−ờng kính trung bình và bề dày của hồng cầu
Is = Đ−ờng kính hồng cầu (àm)/ Bề dày hồng cầu (àm) + Bề dày hồng cầu (àm)
+ Diện tích trung bình của hồng cầu (àm2) S - tbhc = πD2/2 + 4V/D
Với: - D: Đ−ờng kính trung bình của hồng cầu (àm) - V: Thể tích trung bình của hồng cầu (àm3) + Sức kháng của hồng cầu
Theo ph−ơng pháp Hambuger và Part (1974)
Sức kháng của hồng cầu là khả năng chịu đựng của màng hồng cầu ở các nồng độ khác nhau của dung dịch NaCl (0,9%)
Khi hồng cầu bắt đầu vỡ đ−ợc gọi là sức kháng tối thiểu của hồng cầu và ở nồng độ muối làm cho toàn bộ hồng cầu vỡ gọi là sức kháng tối đa của hồng cầu (Trần Cừ, Cù Xuân Dần, 1996 [4]).
Dụng cụ, nguyên liệu: 10 ống nghiệm sạch có vạch 10 ml và 1 ml, n−ớc cất, dung dịch NaCl 1%, pipet, máu bê đ3 có chất chống đông, máy li tâm.
Ph−ơng pháp đo: Dùng n−ớc muối NaCl 1% pha lo3ng với các nồng độ khác nhau theo bảng sau:
Các ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
L−ợng NaCl 1% (ml) 1,8 2,1 2,4 2,7 3,0 3,3 3,6 3,9 4,2 4,5 L−ợng n−ớc cất (ml) 3,2 2,9 2,6 2,3 2,0 1,7 1,4 1,1 0,8 0,5 Nồng độ NaCl (%) 0,36 0,42 0,48 0,54 0,60 0,66 0,72 0,78 0,82 0,90
Dùng ống hút cho vào mỗi ống trên 1 giọt máu đ3 có chất chống đông. Trộn đều, để 15 - 20 phút rồi ly tâm
Kết quả: ở ống có hồng cầu bắt đầu vỡ, dung dịch có màu vàng, ít có hồng cầu lắng xuống d−ới đáy, ở nồng độ đó đ−ợc gọi là sức kháng tối thiểu của hồng cầu. ống hồng cầu vỡ hoàn toàn đầu tiên, dung dịch trong suốt màu đỏ, không có hồng cầu lắng ở đáy, ở nồng độ đó đ−ợc gọi là sức kháng tối đa của hồng cầu.
- Các chỉ tiêu về hệ bạch cầu + Số l−ợng bạch cầu (nghìn/mm3) Đ−ợc xác định bằng máy Screen 18
+ Công thức bạch cầu (%)
Theo Macgregor (1940) và Nikolaiep (1956). Trên tiêu bản máu nhuộm HE (Hematein - Eosin) là tỷ lệ phần trăm giữa các loại bạch cầu.
Dụng cụ, hoá chất: Phiến kính, lamen, kính hiển vi có vật kính dầu, máu bê, cồn cố định, thuốc nhuộm HE.
Quan sát: Sau khiđ3 nhuộm xong tiêu bản để khô, đem quan sát d−ới kinhhiển vi độ phóng đại 15x40. Đếm từng loại bạch cầu, ghi lại, dịch chuyển theo hình "chữ chi". Theo cách phân loại của Shilling, đọc 200 bạch cầu rồi tính. Đơn vị tính:%.
3.4.3. Các chỉ tiêu sinh hóa máu
Trong thực tập và nghiên cứu, chúng tôi đ3 sử dụng máy phân tích các chỉ tiêu sinh hóa tại Công ty TNHH công nghệ và xét nghiệm y học - Medlatec.
Xác định các chỉ tiêu sinh hoá máu bằng cách lấy huyết thanh rồi chạy bằng máy phân tích tại Công ty TNHH công nghệ và xét nghiệm y học - Medlatec.
- Xác định protein tổng số (g%)
- Xác định các tiểu phần protein huyết thanh theo Riner, Westerlnbier (1997) bằng kỹ thuật điện di trên Acetate Cellulose trong dung dịch đệm có pH = 8,8.
Nguyên lý: D−ới tác dụng của dòng điện một chiều trong dung dịch có
pH = 8,8 thì các thành phần của protein huyết thanh đ−ợc tách ra ở các vị trí khác nhau trên phiến Acetate Cellulose. Cố định nhuộm, tẩy màu, khử n−ớc và làm trong phiến Acetate Cellulose sau đó đọc kết quả trên Densitometer Junior-24, b−ớc sóng 525mm.
Dụng cụ và hóa chất:
Dung dịch đệm Tri-Barbuta pH = 8,8 Nguồn điện: Titanplus.
Chất giá: Acetale cellulose
Thuốc nhuộm: Ponceaus.no.55236
Dung dịch tẩy: Axit axetic 5% (CH3COOH 5%) Chất khử n−ớc: Methanol pur tinh khiết
Dung dịch làm trong: Polyethylen giucol: 4 phần Axit axetic glacial: 30 phần
Methanol pur: 70 phần
Cách tiến hành: Dùng microdispener hút 3ml huyết thanh đặt vào các
hố của samplewellplate theo thứ tự đ3 định. Mở nắp buồng điện di. Cắt góc đánh dấu phiến Acetate cellulose rồi ngâm vào dung dịch đệm tr−ớc khi chạy. Vớt, thấm khô bằng Acetate celluilose đặt lên Alegning Base. Dùng Applicator lấy huyết thanh từ Sample Wel1 đặt tên phiến Acetate cellulose. Đặt miếng Acetate quay xuồng d−ới. Đậy nắp điện di, bật điện nguồn, điều chỉnh thời gian và điện thế: 14 phút x 15 volt. Kết thúc điện di, ngâm phiến Acetate cellulose trong dung dịch axit axetic 5% trong 2 phút, làm nh− vậy trong 3 lần. Làm trong băng điện di bằng dung dịch làm trong 10 phút. Sấy khô bằng điện di ở nhiệt độ 600C/10phút. Cuối cùng đo kết quả trên Densitometer Juniơr-24, b−ớc sóng 525nm.
- Xác định hoạt độ enzyme GOT (theo ph−ơng pháp IFCC)
+ Nguyên lý: Dựa theo phản ứng:
GOT
α-Oxaglutarate + L-aspartate L-Glutamate + Oxaloacetate MDH
Oxaloacetate + NADH + H+ L-malate + NAD+
+ Dụng cụ và hóa chất: Điều kiện thí nghiệm (factors) sử dụng ở 370C;
Loại thuốc thử MPR1 (30x2ml); Đo mật độ quang ở chiều dài sóng: Hg 365mm; ống đo 1cm, nhiệt độ 370C, đo ng−ợc ánh sáng; Quang kế 4010.
nhiệt độ 370C, lắc đều rồi cho vào máy đọc quang kế 4010, đọc trong l phút, đọc 3 lần, lấy kết quả cuối cùng.
+ Tính kết quả: Hoạt độ GOT trong huyết thanh đ−ợc tính theo công
thức sau: U/L = 1746 x ∆∆340mm/phút.
Nồng độ thuốc thử ban đầu: TRIS: 88 mmol/1; pH = 7,8; L-aspartate: 246 mmol/1; MDH : 0,64 U/ml; LDH = 0,66 U/ml ; NADH = 0,18 mmol/1; a-Oxơglutarate = 12mmol/1.
- Xác định hoạt độ enzyme GPT
+ Nguyên lý phản ứng:
GPT
α-Oxaglutarate + L-aspartate L-Glutamate + Pyruvat LDH
Pyruvat + NADH + H+ Lactate + NAD+
+ Dụng cụ và hóa chất, cách tiến hành, tính kết quả nh− xác định hoạt
độ enzyme GOT.
Nồng độ thuốc thử ban đầu: Tris = 110 mmol/1; pH = 7,3 ; L- alanine = 550 mmol/1; LDH = 1,3 U/ml; NADH = 0,198 mmol/1; α - Oxoglutarale =16,5 mmol/1.
- Xác định độ dự trữ kiềm trong máu (mg%): xác định bằng máy của Công ty xét nghiệm và Y học - METLATEC
- Xác định hàm l−ợng đ−ờng huyết trong máu (mg%): xác định bằng máy của Công ty xét nghiệm và Y học - METLATEC
3.4.4. Ph−ơng pháp xử lý số liệu
Kết quả thu đ−ợc chúng tôi xử lý theo ph−ơng pháp thống kê sinh học (với dung l−ợng mẫu n ≤ 30 trên máy tính bằng phần mềm Excel.