3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Thắ nghiệm 1: đánh giá ựa dạng di truyền sử dụng marker
Microsatellites hay Simple Sequence Repeats (SSRs) của các dòng ngô nếp
tự phối.
3.3.1.1. Phương pháp phân tắch đa dạng di truyền
+ Gieo trồng 26 dòng mỗi dòng 3 Ờ 5 cây trong nhà lưới, mẫu ựược gieo trong khoảng 2 tuần cho ựến khi có 3 -4 lá thật thì thu mẫu (chú ý kiểm tra vết bệnh nếu không có thể lẫn DNA của vết bệnh) và phân tắch ựa dạng di truyền tại Trung tâm Bệnh cây nhiệt ựới.
3.3.1.2. Các chỉ tiêu ựánh giá trong thắ nghiệm 1
- Tách chiết DNA theo Doye & Doye
- điện di kiểm tra chất lượng và nồng ựộ DNA tổng số. - Số phân ựoạn DNA trên mỗi mồi và tổng số phân ựoạn.
- PCR- SSR, đánh giá ựa dạng di truyền. Phân nhóm di truyền dựa trên số
liệu về khoảng cách di truyền thu ựược ựể chọn tổ hợp lai.
- Số liệu ựược xử lý trên phần mềm Exel và NTSYS pc version 2.1.
3.3.1.3.Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp DOYLE & DOYLE (1987). Chuẩn bị:
1. đệm CTAB 1. β ME
2. Chày, cối sứ sạch 3. Ethanol 70%
4. Chloroform : isoamul alcohol: (24:1) 5. Tube 1.5 ml/giá
7. Mẫu lá (sạch, non) 8. Propanpl lạnh
Tiến hành:
1. Chuẩn bịựệm chiết: cho vào lọ (tube nhựa 15ml) - 12ml CTAB + 120 ul β ME
- Ủ 65oC trong 10 phút 2. Trong tủ hood:
- Nghiền 100 mg lá với 1ml ựệm chiết cho nhuyễn bằng chày cối sứ
- Chuyển vào tube 1.5ml
3. Ủ dịch chiết trong bể nhiệt 65oCtrong 30 phút
4. Ly tâm 5 phút lấy dịch trên tủa ( xấp xỉ 700ul) cho vào tube 1.5 ml mới. 5. Cho 700ul (Ch: iso lạnh ) vào tube chứa 700ul dịch chiết → đảo
ựều→ly tâm 5 phút →lấy dịch trên tủa (600-650ul) cho vào tube mới 6.Cho vào 600ul (Ch: iso) lạnh vào tube →ựảo ựều(nên ựể lạnh 0 oCtrong 1-2 phút→đảo tiếp.
7. Ly tâm 5 phút →lấy cẩn thận dịch trên tủa ( ≈ 400ul) chú ý không ựể
chạm ựầu tuýp vào phân giới hút rất nhẹ → cho vào tube mới 1,5ml 8. Bổ sung thể tắch ⇔400ul propanol lạnh vào tube→ựảo ựều →ựể -20oC/60 phút
9. Ly tâm 10 phút ựể kết tủa DNA( 700ul) 10. Rửa cặn 2 lần bằng ethanol 70%
11. để khô cặn trong không khắ chỗ sạch 30-60 phút
12. Hòa cặn trong 100ul TE và bảo quản mẫu DNA trong tủ lạnh -20 oC [14]
3.3.1.4. Kiểm tra chất lượng và nồng ựộ DNA trên gel agarose 1%
- Pha 1g agarose với 100ml ding dịch ựệm 1x TAE. đun trong lò vi
sóng khoảng 3 phút cho ựến khi tạo thành một dung dịch ựồng nhất.
600C, thêm 3 ul ethidium bromide (10mg/ml) cho vào bình rồi lắc ựều.
- Khay ựổ gel ựược dán băng dắnh kin hai ựầu và cài lược. đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khắ.
- Chờ gel ựông lại trong khoảng 30 phút. Rút lược ra khỏi gel, ựặt gel vào bểựiện di. đổ TAE ngập mặt gel khoảng 2mm.
- Lấy 26 tube 0,5ml sạch ựược ựánh số lần lượt từ 1 ựến 26: lần lượt cho vào
2ul DNA ngô 8ul H20
2ul 6X Loading dye
- Chạy ựiện di ở ựiện thế 100 V trong 30 phút. - Soi gel trên máy soi cực tắm.
3.3.1.5.Quy trình nhân PCR với cặp mồi SSR
- Phản ứng PCR ựược thực hiện trên máy gên Ampự PCR system 9700. Trình tự lấy hóa chất và thành phần của mỗi phản ứng ựược thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.3. Thành phần của một phản ứng PCR
STT Thành phần và nồng ựộ dịch gốc Thể tắch (ul)
1 dd H20 20.38
2 Dearm tag Buffer 2.5
3 d NTPs 0.5
4 Primer ( For.) 0.5
5 Primer (Rev.) 0.5
6 Dearm tag 0.12
- Pha mồi gốc 100 uM nồng ựộ gốc trong TE, pha mối ở nồng ựộ làm việc 20 uM trong TE
Pha vào tube 1,5 ml : 40 ul TE
10 ul mồi gốc 100 uM 50 uL - Pha dNTPs : 60 ul H20 10 ul dATP 10 ul dGTP 10 ul dCTP 10 ul dTTP 100 ul dNTPs
- Chu trình của phản ứng PCR ựược biểu diễn theo sơựồ sau:
Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR tiến hành ựiện di sản phẩm trên gel agarose 3%.
3.3.1.6. Kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR trên gel agarose
* Nguyên tắc: Các phân tử DNA có khối lượng và ựiện tắch khác nhau sẽ ựược tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương trong một ựiện trường
ổn ựịnh với một ựiện thế thắch hợp. 940C 940C 720C 720C 550C 35 chu kỳ 2Ỗ 30Ợ 40Ợ 2Ỗ 40Ợ
* Tiến hành:
Cân 3g agarose với 100ml ding dịch ựệm 1x TAE. đun trong lò vi sóng khoảng 6 phút cho ựến khi tạo thành một dung dịch ựồng nhất.
- để nguội hoặc làm lạnh nhanh dưới vòi nước cho ựến khi nhiệt ựộ 50- 600C, thêm 5 ul ethidium bromide (10mg/ml) cho vào bình rồi lắc ựều.
- Khay ựổ gel ựược dán băng dắnh kin hai ựầu và cài lược. đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khắ.
- Chờ gel ựông lại trong khoảng 30 phút. Rút lược ra khỏi gel, ựặt gel
vào bểựiện di. đổ TAE ngập mặt gel khoảng 2mm.
- Mỗi mẫu sản phẩm sau phản ứng PCR ựược trộn lẫn 5 ul 6X Loading dye.
- Trên bản gel giếng thứ nhất tra 5ul 100bp Plus DNA ladder,các giéng tiếp theo lần lượt tra 15 ul dung dịch sản phẩm phản ứng PCR
- Chạy ựiện di ở ựiện thế 120 V trong 60 phút. - Soi gel trên máy soi cực tắm, và chụp lại hình ảnh.
3.3.1.7. Phương pháp xử lý số liệu
+ Số liệu thu ựược dựa trên hình ảnh xử lý trên phần mềm Exel và NTSYS pc version 2.1.
+ Số 1: các alen có xuất hiện băng ADN + Số 0: các alen không xuất hiện băng ADN + Số 9: Số liệu khuyết thiếu
+ để nghiên cứu mức ựộựa dạng di truyền người ta thường dựa vào 3 công thức tắnh hệ số tương ựồng là: hệ số Jaccard (1908), hệ số Nei & Li (1979) hay còn gọi là hệ số Dice (1945), hệ số SM (Sokal and Michener (1958) hay còn gọi là hệ số phù hợp ựơn giản SMC (simple matching
coefficient). Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hệ số hệ số SM (Sokal
Hệ số Sokal and Michener (1958) hay còn gọi là hệ số phù hợp ựơn giản SMC (simple matching coefficient)
Công thức tắnh là d c b a d a S + + + + = Trong ựó: − a : số băng giống nhau của 2 cá thể − b: số băng chỉ xuất hiện ở cá thể i − c: số băng chỉ xuất hiện ở cá thể j − d: số băng không xuất hiện ở cả 2 cá thể (nhưng xuất hiện ở các cá thể khác)
Hệ số SMC tắnh cả băng không có mặt vì cho rằng băng thiếu tương ứng với các allele ựồng hợp tử lặn.
Sử dụng ma trận khác nhau UPGMA ựể phân tắch các nhóm và so sánh các ma trận tương ựồng, và ma trận giống nhau WPGMA. Trong thắ nghiệm này sử dụng ma trận UPGMA ựể phân tắch các nhóm và so sánh các ma trận tương ựồng.[16]
Trong phân tắch mối quan hệ dựa trên các số liệu marker phân tử, người ta thường sử dụng khoảng cách hình học (D, distance) mặc dù vẫn thường
ựược gọi là khoảng cách di truyền.
Khoảng cách hình học có thể ựược ựo trực tiếp từ hệ số tương ựồng S (similarity index) theo công thức D = 1 Ờ S. [17]
3.3.2. Thắ nghiệm 2: Thắ nghiệm ngoài ựồng ruộng.
- Thắ nghiệm khảo sát không lặp lại, diện tắch ô thắ nghiệm 10 m2
- Vật liệu thắ nghiệm : gồm tổ hợp lai thu ựược trong thắ nghiệm 1 và dòng bố mẹ
3.3.2.1. đánh giá tình hình sinh trưởng và phát triển của cây bố mẹ.
+ Ngày gieo
+ Số ngày từ gieo ựến mọc + Số ngày từ gieo ựến 3-4 lá + Số ngày từ gieo ựến xoáy nõn
+ Số ngày từ gieo ựến trỗ cờ khi quần thể có 70% số cây trỗ cờ tung phấn + Số ngày từ gieo ựến phun râu khi quần thể có 70% số cây phun râu
3.3.2.2. Theo dõi ựánh giá một số tắnh trạng số lượng của dòng vật liệu bố mẹ
+ Chiều cao cây cuối cùng (cm): đo từ gốc sát mặt ựất ựến ựỉnh cờ,
ựược tắnh sau khi trỗ cờ 15 ngày.
+ Chiều cao ựóng bắp (cm): ựo từ gốc sát mặt ựất ựến mắt ựóng bắp trên cùng (bắp thứ nhất).
3.3.2.3. đánh giá khả năng chống chịu sâu bệnh và khả năng chống ựổ của
dòng bố mẹ
+ Sâu ựục thân (%): đếm số cây có sâu ựục thân / ô thắ nghiệm theo dõi
ở giai ựoạn 7-9 lá thật và giai ựoạn chắn sữa.
+ Sâu xám (%): đếm số cây có sâu xám / ô thắ nghiệm theo dõi ở giai
ựoạn 7-9 lá thật và giai ựoạn chắn sữa.
+ Khả năng chống ựổ (%): Theo dõi tất cả các lần nhắc lại sau ựợt gió to và trước khi thu hoạch.
đổ rễ (%): Tắnh phần trăm số cây bị ựổ nghiêng 1 góc >300 so với phương thẳng ựứng thì ựược coi là ựổ rễ.
đổ gẫy thân: Tắnh phần trăm số cây bị gẫy ở ựoạn thân phắa dưới bắp trước khi thu hoạch.
3.3.2.4. đánh giá năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của dòng vật
liệu bố mẹ.
+ Chiều dài bắp (cm): đo từ gốc bắp ựến ựầu múp bắp. + đường kắnh bắp (cm): đo ở vị trắ có ựường kắnh lớn nhất. + Số hàng hạt/ bắp.
+ Số hạt/ hàng.
+ Dạng hạt, màu sắt hạt và P1000 hạt (gam): để xác ựịnh khối lượng 1000 hạt, cân 2 mẫu mỗi mẫu 500 hạt, khối lượng giữa 2 lần chênh lệch nhau không quá 2 gam là chấp nhận ựược. Quy vềẩm ựộ 14%.
+ Khối lượng bắp tươi/ ô (kg). + Khối lượng bắp khô/ ô (kg).
Số bắp/ cây x số hạt/ bắp x P1000 hạt x mật ựộ + NSLT=
100000000
+ Năng suất thực thu (NSTT) ởẩm ựộ 14% ựược tắnh theo công thức, cân năng suất bắp tươi cả ô, cân năng suất bắp khô cả ô, cân năng suất hạt khô cả ô.
3.3.2.5. Kỹ thuật trồng và chăm sóc các dòng bố mẹ ựể lai
- Lên luống cao ựể tránh ngập
- Trồng 1 hàng/luống, lướng cách luống 80 cm, cây cách cây 20 cm - Phân bón : lượng phân bón 5-7 tấn phân chuồng, 100 N, 90 kg P2O5, 60 kg K2O cho dòng bố mẹ. Bón lót tòn bộ phân chuống và lân + 1/3 ựạm + 1/3 kali, bón thúc 1 khi cây 3 Ờ 4 lá với ơ lương ựạm + 1/3 ka li, bón thú 2 khia cây xoắn non toàn bộ lượng phân còn lại. Bón thức kết hợp với xới vun.
- Tưới nước ựảm bảo ựộ ẩm trung bình 70 Ờ 80%, sau khi tưới thảo nước không ựể úng
- Phòng trừ sâu bệnh, cỏ dại kịp thời.
3.3.2.6. đánh giá tình hình sinh trưởng và phát triển của tổ hợp lai.
+ Số ngày từ gieo ựến mọc + Số ngày từ gieo ựến 7-9 lá
+ Số ngày từ gieo ựến trỗ cờ khi quần thể có từ 10- 50 % số cây trỗ cờ
tung phấn
+ Số ngày từ gieo ựến phun râu khi quần thể có 10-50 % số cây phun râu + Số ngày từ phun râu ựến chắn sinh lý.
3.3.2.7. Theo dõi ựánh giá một số tắnh trạng số lượng của các tổ hợp lai. + Theo dõi ựộng thái tăng trưởng chiiều cao cây 10 ngày 1 lần, ựo từ
mặt ựất ựến ựỉnh lá cao nhất
+ Theo dõi ựộng thái ra lá, theo dõi 10 ngày 1 lần. Số lá ựược tắnh từ lá thật thứ nhất ựến cuối cùng, theo dõi bằng ựánh dấu sơn.
+ Chiều cao cây cuối cùng (cm): đo từ gốc sát mặt ựất ựến ựỉnh cờ,
ựược tắnh sau khi trỗ cờ 15 ngày.
+ Chiều cao ựóng bắp (cm): ựo từ gốc sát mặt ựất ựến mắt ựóng bắp
trên cùng (bắp thứ nhất).
3.3.2.8. đánh giá khả năng chống chịu sâu bệnh và khả năng chống ựổ của
các tổ hợp lai.
+ Sâu ựục thân (%): đếm số cây có sâu ựục thân / ô thắ nghiệm theo dõi
ở giai ựoạn 7-9 lá thật và giai ựoạn chắn sữa.
+ Sâu xám (%): đếm số cây có sâu xám / ô thắ nghiệm theo dõi ở giai
ựoạn 7-9 lá thật và giai ựoạn chắn sữa.
+ Khả năng chống ựổ (%): Theo dõi tất cả các lần nhắc lại sau ựợt gió to và trước khi thu hoạch.
đổ rễ (%): Tắnh phần trăm số cây bị ựổ nghiêng 1 góc >300 so với phương thẳng ựứng thì ựược coi là ựổ rễ.
đổ gẫy thân: Tắnh phần trăm số cây bị gẫy ở ựoạn thân phắa dưới bắp trước khi thu hoạch.
3.3.2.9. đánh giá năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các tổ hợp lai.
+ Số bắp/ cây: Tổng số bắp/ ô chia cho tổng số cây/ ô. + Chiều dài bắp (cm): đo từ gốc bắp ựến ựầu múp bắp. + đường kắnh bắp (cm): đo ở vị trắ có ựường kắnh lớn nhất. + Số hàng hạt/ bắp.
+ Số hạt/ hàng.
+ Dạng hạt, màu sắt hạt và P1000 hạt (gam): để xác ựịnh khối lượng 1000 hạt, cân 2 mẫu mỗi mẫu 500 hạt, khối lượng giữa 2 lần chênh lệch nhau không quá 2 gam là chấp nhận ựược. Quy vềẩm ựộ 14%.
+ Khối lượng bắp tươi/ ô (kg). + Khối lượng bắp khô/ ô (kg).
Số bắp/ cây x số hạt/ bắp x P1000 hạt x mật ựộ + NSLT=
100000000
+ Năng suất thực thu (NSTT) ởẩm ựộ 14% ựược tắnh theo công thức, cân năng suất bắp tươi cả ô, cân năng suất bắp khô cả ô, cân năng suất hạt khô cả ô.
3.3.2.10. Kỹ thuật trồng và chăm sóc các tổ hợp lai
- Làm ựất và gieo hạt: đất cày sâu 25-30 cm, bừa nhỏ ựảm bảo ựộ tơi xốp, bằng phẳng, sạch cỏ dại. Trước khi gieo hạt lên luống rộng 1,2 m nếu trồng 2 hàng và rộng 0,7 m nếu trồng 1 hàng, luống cao 20-25 cm. Sau ựó rạch hàng ựảm bảo hàng cách hàng 70 cm, gieo hạt cách hạt 25 cm ựể ựảm bảo mật ựộ 50000 cây/ ha. Gieo hạt sâu 3-4 cm.
- Phân bón: Lượng phân bón cho 1 ha: 5-7 tấn phân chuồng, 120 N, 90 kg P2O5, 60 kg K2O.
Cách bón:
- Bón lót: Trước khi gieo hạt bằng cách bón rải hoặc bón theo hàng rạch sau ựó phủ 1 lớp ựất mỏng kắn phân.
Lượng bón: Toàn bộ phân chuồng và phân lân. - Bón thúc: chia làm 3 ựợt.
Ớ đợt 1: Khi cây có 3-4 lá thật bón 1/3 N + 1/2 K2O.
Ớ đợt 2: Khi cây có 7-9 lá thật bón 1/3 N + 1/2 K2O.
Ớ đợt 3: Khi cây xoáy nõn (trước trỗ 15 ngày) bón toàn bộ
lượng phân ựạm còn lại.
- Chăm sóc:
+ Từ khi gieo ựến khi ngô 3 lá thật: Tiến hành xới xáo phá váng, bắt sâu. + Khi ngô 3-4 lá thật: Bón thúc ựợt 1 kết hợp xới xáo nhẹ bề mặt, làm
