3. ðỐ IT ƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
3.3.1. Bố trí thí nghiệm
3.3.1.1 Thí nghiệm nghiên cứu khả năng gây u thực nghiệm trên chuột thí nghiệm bằng dòng tế bào LLC
Chuột ñược chia ra thành các lô, mỗi lô gồm 10 chuột BALB/c 6 tuần tuổi, khoẻ mạnh.
• Lô 1: Tiêm 1×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào bắp ñùi
• Lô 2: Tiêm 1×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào dưới da lưng
• Lô 3: Tiêm 2×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào bắp ñùi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 28
• Lô 4: Tiêm 2×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào dưới da lưng
• Lô 5: Lô ñối chứng, chuột ñược tiêm 0,1ml dung dịch sinh lý/con
3.3.1.2. Xác ñịnh liều ñộc cấp tính LD50 gây chết 50% ñộng vật thí nghiệm của hoạt chất Paeonol bằng ñường uống.
50 chuột BALB/c khoẻ mạnh, nuôi tại khu nuôi ñộng vật của Viện Công nghệ
sinh học, ñược chia làm 5 lô (10 chuột/lô), chuột bị bỏ ñói hoàn toàn 16 giờ
trước khi cho uống chế phẩm PAN.
• Lô 6: Chế phẩm PAN ñược cho uống một lần duy nhất ở nồng ñộ
2000 mg/kg thể trọng (kgP)
• Lô 7: Chế phẩm PAN ñược cho uống một lần duy nhất ở nồng ñộ
2500 mg/kgP
• Lô 8: Chế phẩm PAN ñược cho uống một lần duy nhất ở nồng ñộ
3000 mg/kgP
• Lô 9: Chế phẩm PAN ñược cho uống một lần duy nhất ở nồng ñộ
3500 mg/kgP
• Lô 10: Chế phẩm PAN ñược cho uống một lần duy nhất ở nồng ñộ
4000 mg/kgP
Sau khi cho uống chế phẩm 1-2 giờ, chuột ñược nuôi dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ ñể xác
ñịnh số chuột chết trong từng lô sau khi cho uống PAN và tính giá trị LD50 .
3.3.1.3. Nghiên cứu ñộc bán trường diễn của hoạt chất paeonol khi cho chuột thí nghiệm uống liều thấp trong thời gian dài.
Nghiên cứu ñộc tính bán trường diễn ñược tiến hành theo phương pháp của Abraham (1978): 50 chuột BALB/c khoẻ mạnh, nuôi tại khu nuôi ñộng vật của Viện Công nghệ sinh học, ñược chia làm 3 lô (10 chuột/lô), hàng ngày cho uống chế phẩm PAN liều thấp và theo dõi trong 4 tuần.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 29
• Lô 11: Chuột thí nghiệm ñược cho uống PAN với liều 1000 mg/kgP/ngày
• Lô 12: Chuột thí nghiệm ñược cho uống PAN với liều 500 mg/kgP/ngày
• Lô 13: Chuột thí nghiệm chỉ cho uống nước sinh lý
3.3.1.4. Nghiên cứu tìm hiểu hoạt tính của Paeonol khi sử dụng làm chất bảo vệ ñể phòng và ngăn chặn sự phát triển khối u ung thư trên chuột ñã ñược gây u thực nghiệm.
• Lô 14: uống PAN liều 100mg/kgP/ngày trước 4 tuần sau ñó tiêm tế
bào LLC ñể gây u và vẫn tiếp tục cho uống PAN thêm 6 tuần nữa.
• Lô 15: uống PAN liều 200mg/kgP/ngày trước 4 tuần sau ñó tiêm tế
bào LLC ñể gây u và vẫn tiếp tục cho uống PAN thêm 6 tuần nữa.
• Lô 16: tiêm tế bào LLC ñể gây u, ñồng thời uống chế phẩm PAN liều 100 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa.
• Lô 17: tiêm tế bào LLC ñể gây u, ñồng thời uống chế phẩm PAN 200 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa.
• Lô 18: tiêm tế bào LLC ñể gây u, sau khi có u sơ cấp thì cho uống PAN liều 250 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa.
• Lô 19: tiêm tế bào LLC ñể gây u ñồng thời cho uống PAN liều 500 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa.
• Lô 20: tiêm tế bào LLC ñể gây u ñồng thời cho uống PAN liều 1000 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa.
• Lô 21: tiêm tế bào LLC ñể gây u ñồng thời cho uống PAN liều 1500 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa.
• Lô 22 (ñối chứng): chỉ tiêm tế bào LLC và cho uống PBS là dung môi ñược sử dụng ñể pha PAN trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 30
muối sinh lý trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm
Với bố trí thí nghiệm như trên, chúng tôi sẽ kiểm tra ñược khả năng bảo vệ cơ thể của PAN trước khi gây u bằng tế bào ung thư LLC ở các liều lượng khác nhau (lô 14, 15, 16, 17). ðồng thời, sau khi chuột ñã xuất hiện u do bị
tiêm tế bào ung thư LLC, chuột ñược sử dụng PAN như chất chữa trị ở các liều lượng khác nhau (lô 18, 19, 20, 21). Lô số 22 ñược sử dụng như là ñối chứng của thí nghiệm.
Theo dõi chuột hàng ngày, cân khối lượng và ño kích thước khối u sơ
cấp hàng tuần trên chuột thí nghiệm theo phương pháp của Abrham (1978) và của Iigo et al (1991) ñể xác ñịnh khả năng ức chế khối u của PAN. Thể
tích khối u ñược tính theo công thức của Iigo (1991).
V = chiều dài (khối u) × chiều rộng2(khối u)/2 Trong ñó: V: thể tích khối u.
3.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư invitro
Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thưñược tiến hành theo phương pháp
ñang lưu hành tại Viện ung thư Quốc Gia Mỹ NCI (National Cancer Institute) và ñược WHO công nhận
Dòng tế bào ung thư LLC (Lewis lung carcinoma) do trường ðại học Universit degli Studi di Milano Italia cung cấp ở dạng ñược bảo quản trong Nitơ lỏng (-196oC) vì vậy tế bào này sẽ phải ñánh thức trước khi nhân nuôi ở
các môi trường khác nhau
* Phương pháp ñánh thức tế bào (Thawing)
Lấy tế bào ra khỏi Nitơ lỏng, ñưa vào cốc nước 37oC cho ñến khi dung dịch trong ống tan ñá hoàn toàn, lau phía ngoài ống cất bằng cồn 70o ñể khử
trùng. Chuyển tế bào sang một ống li tâm quay với tốc ñộ 300 vòng/phút trong 5 phút. Sau ñó hút bỏ dịch nổi ñể loại DMSO (Dimethyl Sulphoixide).
Chuyển tế bào sang chai nuôi, nhỏ từ từ từng giọt môi trường nuôi cấy thích hợp vào chai nuôi. Tế bào mới ñánh thức rất nhạy cảm, chúng dễ bị chết
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 31
nếu ñưa môi trường mới vào quá nhanh.
Tiếp theo, ñể chai nuôi vào tủấm 37oC, 5%CO2. * Phương pháp nhân nuôi tế bào ung thư
Tế bào sau khi ñược ñánh thức từ N2 lỏng sẽ ñược nuôi cấy trong môi trường ñủ phù hợp trong 3-5 ngày
Khi tế bào ñã mọc dàn ñều thành ñơn lớp ở ñáy chai nuôi cấy thì cần chuyển sang chai nuôi cấy mới. Tỉ lệ cấy chuyển là 1: 3 hoặc 1: 5 (tuỳ theo loại tế bào và tuỳ vào mục ñích sử dụng). Trung bình sau 2- 3 ngày, môi trường nuôi phải ñược thay mới. Vì lúc này pH và chất dinh dưỡng cần cho sự
phát triển của tế bào ñã thay ñổi. Nếu môi trường không ñược thay mới ñúng lúc, tế bào sẽ chết.
Quy trình cấy chuyển:
- Loại môi trường cũ: dùng pipetman hút môi trường cũ ra khỏi chai nuôi. - Rửa tế bào bằng PBS vô trùng
- Làm rời tế bào bằng Trypsin- EDTA: cho vào khoảng 0,5 - 0,6ml trypsin/1chai nuôi diện tích bệ mặt nuôi 25 cm2, ủ ở 37oC từ 3 – 5 phút ñể tế
bào tách khỏi bề mặt chai nuôi, khi tế bào ñã tách khỏi bề mặt chai nuôi sẽ ñược làm rời nhờ bơm hút ñẩy hay vỗ nhẹ.
- Li tâm loại bỏ Trypsin- EDTA ở tốc ñộ 1000vòng/phút trong 5 phút - Pha loãng tế bào với tỉ lệ 1: 3
- ðưa vào chai nuôi cấy mới với 5 – 7 ml môi trường nuôi cấy mới phù hợp
- ðể vào tủấm 37oC, 5% CO2 và tiếp tục nuôi.
3.3.3. Phương pháp ñếm tế bào
Tế bào trước khi ñược tiêm cho chuột ñể gây u sẽ ñược ñếm và ñiều chỉnh tới nồng ñộ tế bào thích hợp. Tế bào ñược ñếm theo phương pháp của Neubauer
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 32
tế bào bám dính) trong 3 – 5 phút, ñể các tế bào hoàn toàn tách rời hẳn nhau Công thức tính theo Newbauer:
N = m × V × 5 × 104 × tb
Trong ñó: N: Số lượng tế bào
m: Số tế bào trung bình ñếm trên 5 ô V: Thể tích chung
Tb: hệ số pha loãng
Dưới ñây là một số hình ảnh buồng ñếm tế bào Neubauer
Hình 3.1: Hình ảnh buồng ñếm Neubauer 3.4. Xử lý số liệu
Số liệu thu ñược trong quá trình nghiên cứu ñược xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học theo chương trình Excel:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 33 - Số trung bình: n X X n 1 i i ∑ = =
Trong ñó: Xi: giá trị các mẫu quan sát
X: số trung bình n: dung lượng mẫu - ðộ lệch chuẩn: ( ) 1 n X Xi 2 − − Σ = δ Với n < 30 - Sai số trung bình: mx = ± 1 n S − Với n < 30
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 34