- Phõn loại hiện tượng rối loạn quỏ trỡnh sinh sản do nguyờn nhõn bệnh lý buồng trứng.
3.3. Phương phỏp nghiờn cứu
3.3.1. Phương phỏp ủỏnh giỏ cỏc chỉ tiờu sinh sản
- ðỏnh giỏ cỏc chỉ tiờu sinh sản bằng phương phỏp theo dừi qua sổ sỏch phối giống, ủiều tra và ghi chộp trực tiếp từ cỏc hộ chăn nuụi;
- Tuổi phối lần ủầu: ủược tớnh từ khi con vật sinh ra tới khi bũ ủược phối giống lần ủầu (thỏng);
- Tuổi ủẻ lứa ủầu: ủược tớnh từ khi con vật sinh ra ủến khi ủẻ lứa ủầu tiờn (thỏng);
- Khối lượng cơ thể gia sỳc khi phối giống lần ủầu, khi ủẻ lần ủầu ủược xỏc ủịnh bằng cỏch cõn trực tiếp hoặc bằng phương phỏp ủo rồi tớnh theo cụng thức khối lượng bũ (Nguyễn Văn Thiện, 1996 [28]) ủú là:
P = VN2 x DTC x 87,5
Trong ủú: VN là vũng ngực bũ (ủo chu vi vũng ngực sỏt sau xương bả vai, ủơn vị tớnh bằng một).
DTC: Là khoảng cỏch từ khớp xương bả vai ủến u xương ngồi (một). - Thời gian ủộng dục lại sau khi ủẻ của ủàn bũ lai hướng sữa: là từ khi con vật ủẻủến lần ủộng dục ủầu tiờn sau ủú (ngày).
- Khoảng cỏch giữa 2 lứa ủẻ: Xỏc ủịnh khoảng cỏch giữa hai lứa ủẻ là khoảng thời gian từ lần ủẻ này ủến lần ủẻ tiếp theo (ngày).
Tổng số bũ rối loạn sinh sản - Tỷ lệ bũ bị rối loạn sinh sản (%) = Tổng số bũ trong ủộ tuổi sinh sản x100 Số bũ cú chửa phối lần 1 - Tỷ lệ thụ thai (%) = ΣSố bũ phối X 100 Σ số lần phối - Hệ số phối giống (lần) = Σ số bũ cú chửa
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 33
3.3.2. Phương phỏp ủịnh lượng hormone FSH, Progesterone
ELISA là phương phỏp ủịnh lượng miễn dịch enzyme dựa trờn nguyờn lý của sự kết hợp ủặc hiệu giữa khỏng thể-khỏng nguyờn. Khi cho tiếp xỳc giữa khỏng thể và khỏng nguyờn ủó kớch thớch sinh ra chỳng thỡ phản ứng giữa khỏng thể – khỏng nguyờn sẽ xảy ra một cỏch ủặc hiệu. Về bản chất, sự kết hợp giữa khỏng thể – khỏng nguyờn chớnh là sự liờn kết giữa cỏc nhúm chức khỏc nhau của khỏng nguyờn với trung tõm hoạt ủộng của khỏng thể nhờ cỏc lực liờn kết ủặc trưng là lực Wander – Wals, lực liờn kết Hydro và lực liờn kết tĩnh ủiện.
Trong mỗi phõn tử khỏng thể (IgG) cú hai trung tõm hoạt ủộng nờn cựng lỳc nú cú thể liờn kết với hai phõn tử khỏng nguyờn cựng loại, cũn mỗi phõn tử khỏng nguyờn lại cú nhiều nhúm chức quyết ủịnh tớnh chất khỏng nguyờn nờn nú cú thể kết hợp cựng lỳc với nhiều phõn tử khỏng thể.
ELISA là một phương phỏp ủịnh lượng miễn dịch enzyme khụng gõy tổn thương ủến tớnh miễn dịch của khỏng nguyờn, khỏng thể, khỏng khỏng thể khi sử dụng enzyme ủể gắn trong quỏ trỡnh tạo phản ứng cạnh tranh. Phương phỏp này cú u ủiểm làm tăng ủộ nhạy của phản ứng miễn dịch cạnh tranh thụng qua việc sử dụng cỏc phản ứng miễn dịch ủặc biệt, sử dụng nhiều chất khỏc nhau ủểủỏnh dấu khỏng nguyờn, khỏng thể.
Phương phỏp ELISA thường sử dụng cỏc enzyme cú hoạt tớnh cao như peroxydase (chế từ củ cải ủen), glucose-oxydase (chế từ nấm mốc) hoặc
βgalacto-oxydase (chế từ vi khuẩn E.coli) ủể gắn hormone giống nhau (Ag*) trong ủú peroxydase ủược sử dụng một cỏch thụng dụng nhất. Trong quỏ trỡnh ủịnh lượng hormone, ngời ta sử dụng cơ chất 3.3’ diaminobenzidin ủể phỏt hiện phức hợp khỏng thể-khỏng nguyờn gắn enzyme. Dưới tỏc dụng của peroxydase cơ chất núi trờn sẽ tạo thành sản phẩm cú màu nõu thẫm cú thể nhỡn thấy bằng mắt thường.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 34
* ðịnh lượng FSH bằng phản ứng ELISA giỏn tiếp
Phương phỏp ELISA ủịnh lượng FSH trong ủề tài nghiờn cứu của chỳng tụi dựa trờn nguyờn lý của phương phỏp ELISA giỏn tiếp. Bộ Kits ủược mua của hóng Calbiotech của Mỹ.
● Nguyờn lý
- Cỏc mẫu huyết thanh ủược lấy cỏch nhau 7 ngày, mẫu ủầu tiờn ủược lấy vào ngày bất kỳ (tớnh là ngày 0), cỏc mẫu sau lấy vào cỏc ngày 7, 14 và 21. Mẫu ủược bảo quản và ủưa về phũng thớ nghiệm ủể xử lý mẫu;
- Cho khỏng thể khỏng FSH vào (KT1 - dịch nổi của mụi trường nuụi cấy tế bào). Rửa bản ủể loại bỏ những khỏng thể khụng liờn kết ủặc hiệu với khỏng nguyờn, chỉ cũn lại phức hợp KN - KT tương ứng ủược giữ lại;
- Cho thờm KT2 ủó gắn enzyme vào phức hợp trờn, khỏng thể này sẽ liờn kết với phức hợp KN - KT tạo ra phức hợp mới KN - KT1 - KT2 - E. Rửa bản, những phần khỏng thể 2 khụng liờn kết sẽ bị rửa trụi;
- Nhỏ cơ chất vào mỗi giếng, quan sỏt sựủổi màu;
- ðọc kết quả bằng mỏy ủo mật ủộ quang học tương ứng với bước súng (λ = 410 ηm) của màu thể hiện. KT1 càng nhiều sẽ cú hàm lượng KT1 - KT2 càng cao và do ủú lượng enzyme ủược giữ lại càng nhiều, dẫn tới màu càng rừ, giỏ trị OD càng lớn. Ngược lại nếu trong mẫu khụng cú khỏng nguyờn (FSH) dẫn tới khụng cú khỏng thể gắn enzyme ủược giữ lại và do ủú khụng cú màu và giỏ trị OD sẽ bằng giỏ trị OD của mẫu ủối chứng trắng.
● Cỏc bước tiến hành
- Chuẩn bị giếng
- Phủ bản bằng 50àl khỏng huyết thanh FSH (Hai bước trờn nhà sản xuất bộ Kits ủó làm sẵn)
- Cho 50àl huyết thanh, sữa của bũ chậm ủộng dục vào cỏc giếng - ðưa vào mỗi giếng 100 àl khỏng huyết thanh FSH cú gắn enzym - ðem ủ bản 30 phỳt ở nhiệt ủộ phũng
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 35 - Rửa loại bỏ dung dịch trong cỏc giếng
- Rửa bản 3 lần bằng washing buffer;
- ðưa vào mỗi giếng 100 àl dung dịch cơ chất TMB - ðem ủ bản ở nhiệt ủộ phũng trong 10 phỳt;
- Cho vào mỗi giếng 50 àl dừng phản ứng ;
- ðọc phản ứng bằng mỏy ủo ELISA ở bước súng 450nm.
Lưu ý: vỡ thớ nghiệm ủũi hỏi ủộ chớnh xỏc rất cao nờn mỗi mẫu cần lặp lại ớt nhất 2 lần (mỗi mẫu làm vào 2 giếng) theo hỡnh 3.1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A S1 S1 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33 B S2 S2 2 2 10 10 18 18 26 26 34 34 C S3 S3 3 3 11 11 19 19 27 27 35 35 D S4 S4 4 4 12 12 20 20 28 28 36 36 E S5 S5 5 5 13 13 21 21 29 29 37 37 F S6 S6 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 G H H 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39 H L L 8 8 16 16 24 24 32 32 40 40
Hỡnh 3.1. Sơ ủồ bố trớ mẫu vào cỏc giếng trong phản ứng ELISA
Ghi chỳ: Cỏc giếng nhựa ở cột dọc 1 và 2 chứa mẫu chuẩn ủể so sỏnh, trong ủú:
S1 – S6: Dóy dung dịch FSH chuẩn cú nồng ủộ (mlU/ml) lần lượt FSH: 0, 5, 10, 25, 50, 100. (mlU/ml).
H: mẫu chuẩn cú nồng ủộ FSH cao L: mẫu chuẩn cú nồng ủộ FSH thấp
H và L luụn ủược ủo ở mọi lần thớ nghiệm nhằm tớnh hệ số sai khỏc và ủộ lệch chuẩn giữa cỏc lần thớ nghiệm
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 36 mẫu chứa FSH cần ủịnh lượng, mỗi mẫu 2 giếng ủỏnh số thứ tự giống nhau.
Từ kết quả thu ủược ta tiến hành vẽ ủường cong chuẩn biểu thị mối tương quan giữa mật ủộ quang học (Optical Density - OD) với nồng của dóy dung dịch chuẩn. ðường cong chuẩn FSH cú dạng như sau:
Hỡnh 3.2. Mối tương quan giữa mật ủộ quang học (OD) và nồng ủộ FSH (mlU/ml)
(ủường chuẩn trờn ủược dựng theo chương trỡnh phần mềm TableCurve 2D phiờn bản số 4).
ðối chiếu kết quả về mật ủộ quang học với ủường cong chuẩn biểu thị nồng ủộ FSH của dóy dung dịch chuẩn, ta xỏc ủịnh ủược nồng ủộ của FSH và trong mẫu cần ủịnh lượng.
* ðịnh lượng Progesterone bằng phản ứng ELISA cạnh tranh
- Phương phỏp ELISA ủịnh lượng progesterone trong ủề tài nghiờn cứu của chỳng tụi dựa trờn nguyờn lý của phản ứng cạnh tranh giỏn tiếp. Bộ Kits ủược mua của hóng Calbiotech của Mỹ.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 37 ● Nguyờn lý
- Cho lần lượt vào cỏc giếng nhựa ủó ủược gắn trước khỏng khỏng thể ủặc hiệu của progesterone.
+ Một lượng mẫu nhất ủịnh cú chứa progesterone cần chẩn ủoỏn.
+ Một lượng nhất ủịnh dung dịch progesterone gắn enzyme (Horse Radish Peroxydase).
+ Một lượng khỏng thểủặc hiệu khỏng progesterone.
- ðể cho quỏ trỡnh gắn giữa progesterone-khỏng thể-khỏng khỏng thể xẩy ra, người ta ủem ủ giếng trong một thời gian nhất ủịnh sau ủú ủổ bỏ dung dịch trong giếng và rửa ủể loại bỏ phần khụng gắn.
- Cho cơ chất vào giếng và ủ lần thứ hai ủể tạo phản ứng cạnh tranh. Phản ứng cạnh tranh giữa cơ chất và enzyme sẽ tạo màu cho dung dịch.
Hỡnh ảnh cơ chế cạnh tranh trong phản ứng ELISA ủược mụ tả như trong hỡnh 3.3.
Hỡnh 3.3. Cơ chế trong phản ứng ELISA cạnh tranh (Henricks R.C, 1986 [45]) Khỏng khỏng thể Progesterone Khỏng thể khỏng Progesterone Progesterone (mẫu) Progesterone ủó gắn enzyme Cơ chất 3 2 1
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 38 Căn cứ vào mức ủộ biểu hiện về màu của dung dịch cần ủịnh lượng so với màu của dóy dung dịch chuẩn, ngời ta cú thể nhận biết nồng ủộ progesterone thụng qua quan sỏt sự khỏc nhau về màu sắc của dung dịch trong giếng bằng mắt hoặc bằng mỏy so màu quang phổ.
Lượng progesterone gắn enzyme và lượng progesterone cú trong mẫu cần ủịnh lượng cú mối tương quan tỷ lệ nghịch khi cựng gắn khỏng thể trong giếng.
Nếu nồng ủộ progesterone trong mẫu cần phõn tớch càng cao thỡ càng cú ớt progesterone-enzyme ủược gắn vào khỏng thể trong giếng do ủú màu của phản ứng khi cú cơ chất vào trong giếng sẽ nhạt thể hiện ở hỡnh 3.4.
Hỡnh 3.4. Trường hợp nồng ủộ progesterone trong mỏu cao
Nếu nồng ủộ progesterone trong mẫu cần phõn tớch thấp sẽ cú nhiều progesterone-enzyme ủược gắn vào khỏng thể trong giếng do ủú màu của phản ứng khi cho cơ chất vào trong giếng sẽ sẫm màu thể hiện ở hỡnh 3.3
Mẫu
NỒNG ðỘ PROGESTERONE TRONG MÁU CAO
Mẫu
HRA-P4
NỒNG ðỘPROGESTERONE TRONG MÁU CAO
Nhạt màu
Rửa bỏ phần khụng gắn
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 39
Hỡnh 3.5. Trường hợp nồng ủộ progesterone trong mỏu thấp (Henricks R.C, 1986 [45])
● Cỏc bước tiến hành: - Chuẩn bị giếng
- Phủ bản bằng 10àl khỏng khỏng thể Progesterone và khỏng thể khỏng Progesterone (Hai bước trờn nhà sản xuất bộ Kits ủó làm sẵn).
- Cho 10 àl huyết thanh, sữa của bũ chậm ủộng dục vào cỏc giếng - ðưa vào mỗi giếng 100 àl Progesterone gắn enzym
- ðem ủ bản 60 phỳt ở nhiệt ủộ phũng - Rửa loại bỏ dung dịch trong cỏc giếng - Rửa bản 3 lần bằng washing buffer;
- ðưa vào mỗi giếng 100 àl dung dịch cơ chất TMB - ðem ủ bản ở nhiệt ủộ phũng trong 15 phỳt;
- Cho vào mỗi giếng 50 àl dừng phản ứng ;
- ðọc phản ứng bằng mỏy ủo ELISA ở bước súng 450nm.
Cỏc mẫu ủược bố trớ trờn cỏc giếng tương tự như ủó làm với FSH với dóy S1 – S6 là dóy dung dịch Progesterone chuẩn cú nồng ủộ (ηg/ml) lần lượt là: 0; 2,5; 5; 10; 20; 40 ηg/ml.
Mẫu Mẫu
HRA-P4
NỒNG ðỘ PROGESTERONE TRONG MÁU THẤP
Sẫm màu
Rửa bỏ phần khụng gắn
TMB (cơ chất)
NỒNG ðỘPROGESTERONETRONG MÁU THẤP
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 40
Hỡnh 3.6. Mối tương quan giữa mật ủộ quang học (OD) và nồng ủộ Progesterone (ηg/ml)
(ðường chuẩn trờn ủược dựng theo chương trỡnh phần mềm TableCurve 2D phiờn bản số 4).
Như vậy khỏc với FSH, kết quả của ủường cong chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa mật ủộ quang học với nồng ủộ Progesterone sẽ là tỷ lệ nghịch. Nếu quan sỏt chung ta cú thể nhận thấy giếng nào càng nhạt màu thỡ nồng ủộ hormone trong mẫu càng cao.
3.3.3. Sử dụng hormone sinh dục và chế phẩm hormone ủể ủiều trị hiện
tượng rối loạn quỏ trỡnh thụ tinh do nguyờn nhõn bệnh lý buồng trứng
* Sử dụng prostaglandin (PGF2α) ủể kớch thớch ủộng dục.
PGF2α do hóng Intervet (Hà Lan) sản xuất, tiờm PGF2α cho bũ cú thể vàng tồn lưu. Trong thớ nghiệm, chỳng tụi chỉ tiờm PGF2α với những bũ mạnh khoẻ và khụng viờm ủường sinh dục, mỗi liều 25 mg/con. Theo dừi ủộng dục và phối giống trong thời gian từ 12 - 16 giờ kể từ khi bũ bắt ủầu ủộng dục, nếu khụng thấy ủộng dục thỡ ủến ngày thứ 11 tiờm tiếp 25 mg/con, tiếp tục theo dừi ủộng dục và phối giống cho bũ trong khoảng 72 – 96 giờ, cho dự bũ cú ủộng dục hay khụng. Tỷ lệ thụ thai ủược tớnh ở cả 2 chu kỳ (Tăng Xuõn Lưu và Cs, 2003 [22]).
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nụng nghiệp ... 41
Tiờm PGF2α Tiờm PGF2α Ngày
Ngày 1 11
* Sử dụng GnRH kết hợp với PGF2α trong trường hợp thiểu năng buồng trứng:
ðối với buồng trứng kộm phỏt triển và u nang buồng trứng, cú thể kết hợp thụt lugol 0,1 – 0,2% v à tiờm oxytoxin 40UI
Tiờm GnRH Tiờm PGF2α Tiờm GnRH 100 mg/con 25 mg/con 100 mg/con
Ngày 1 Ngày 7 Ngày 9