Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) là kỹ thụât khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản cịn được gọi là phương pháp vi vệ tinh (microsattellite).
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………19
Các đoạn lặp lại gồm từ 2 đến 6 cặp nucleotit được lặp đi lặp lại nhiều lần trong hệ gen. ðoạn SSR điển hình là đoạn trình tự gồm 2 - 3 cặp nucleotit, lặp lại từ 9 - 30 lần. Các đoạn trình tự bảo thủ thường dùng trong kỹ thuật SSR là ATT, AT, CTT, CT... Các đoạn lặp lại cĩ kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ theo từng lồi, từng giống cây trồng và vật nuơi.
Ngay trong một genome cũng cĩ mức độ lặp lại ở các nhiễm sắc thể khác nhau. Ở các động vật cĩ vú, một đoạn trình tự lặp lại một vài lần chiếm >50%, cịn đoạn lặp lại hàng trăm nghìn lần chỉ chiếm khoảng 20 - 25%. Các đoạn SSR thường ở vùng gần tâm động hoặc đầu mút của NST và cĩ vai trị điều hồ hoạt động của gen.
Kỹ thuật SSR là một loại marker chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống cây trồng, vật nuơi khác nhau trong cùng một lồi động vật hay thực vật. Ngày nay sử dụng kỹ thuật SSR để xây dựng bản đồ liên kết, phân lập (gen), xác định quan hệ di truyền giữa các dịng, giống cây trồng, vật nuơi và chẩn đốn cặp lai cho ưu thế lai (C. J. Bell, 1994 và D. Tautz, 1984) [30], [70].
2.5.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng
Trước đây, việc ứng dụng các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nơng học quan trọng đã được nhiều nhà chọn giống quan tâm và sử dụng, nĩ được xem như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Tuy nhiên, việc ứng dụng cịn gặp nhiều hạn chế. Vì thế chỉ thị phân tử ra đời đã trở thành cơng cụđắc lực hổ trợ phương pháp truyền thống, giải phĩng cho các nhà chọn giống một lượng lớn cơng việc khi phải tiến hành chọn lọc. Các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra những ưu thế của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái như sau:
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………20
1. Chỉ thị phân tử cĩ thể xác định kiểu gen của các locus tại bất kỳ giai đoạn nào và bất cứ mức độ nào (tế bào, mơ hay tồn bộ cơ thể).
2. Số lượng các chỉ thị AND là rất lớn, trong khi đĩ số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế.
3. Các alen khác nhau thường khơng liên kết với các hiệu ứng cĩ hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình khơng mong muốn.
4. Các alen của các chỉ thị phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào. Các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội – lặn, do đĩ bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai.
5. ðối với chỉ thị hình thái các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể trong quần thể phân ly. Trong khi đĩ, chỉ thị phân tử hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất ít gặp.
Ngày nay, phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử là một phương pháp hữu hiệu trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà chọn giống truyền thống khơng hoặc rất khĩ giải quyết. Ngồi ra, phương pháp này cịn giúp ta chọn lọc những cá thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra.
Gần đây, các nhà khoa học đã phân tích cặn kẽ một số mơ hinh MAS. Theo đĩ, chỉ cần trải qua 3 - 4 thế hệ chứ khơng phải 6 – 8 thế hệ (ngay cả khi quần thể chọn giống cĩ kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế) là cĩ thểđạt được mục tiêu của mình (Frey và cs, 2004) [38].
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………21 2.5.3.1. Một số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng
* Trên thế giới
Trong những năm gần đây, với sự phát triển nhanh chĩng của khoa học cơng nghệ nĩi chung và cơng nghệ sinh học nĩi riêng. Ứng dụng chỉ thị phân tử đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong việc đánh giá mối quan hệ di truyền và lập bản đồ liên kết gen. Qua đĩ, đã tạo ra nhiều giống mới thuộc nhiều lồi cây trồng khác nhau, mang các đặc tính mong muốn phù hợp với nhu cầu của sản xuất.
Những nghiên cứu gần đây sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền của nhiều loại cây trồng khác nhau như lúa, lúa mỳ, cà chua, khoai tây, đậu tương... đã mang lại nhiều thành cơng lớn cho các nhà chọn giống. Các nhà khoa học Trung Quốc đã sử dụng 28 cặp mồi SSR phân tích 90 giống đậu đũa, kết quảđã nhân được 128 allen với mức tương đồng di truyền trung bình là 44%.
Zhao yong, 2002 [76] phân tích đa dạng di truyền của 23 giống lúa từ 5 quốc gia khác nhau trên thế giới với 16 cặp mồi SSR. Kết quả thu được số alen trên locus dao động từ 2 đến 10 (trung bình 5,2). Tương đồng di truyền của 23 giống lúa dao động từ 0,13 đến 0,64. Phân tích sơ đồ hình cây cho thấy 23 giống nghiên cứu được phân thành 2 nhĩm chính. Qua đĩ một lần nữa tác giả khẳng định rằng cĩ thể sử dụng chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền của các giống lúa ở các điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và mối quan hệ trong phả hệ.
Theo Li Z. C và cs, 2004 [53] nghiên cứu đa hình của 113 dịng/giống lúa vùng Yunnan đã đưa ra kết luận rằng, sự đa dạng của lồi phụ Japonica cao hơn Indica. Trước đĩ, Song Z. P. và cs, 2003 [68] đã sử dụng 23 cặp mồi SSR phân tích đa hình của 232 cá thể thuộc 6 quần thể lúa (03 quần thể từ
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………22
Jiangxi và 03 quần thể từ Hunan – Trung Quốc). Kết quả thu được tổng số 115 alen và các nhà nghiên cứu cho rằng quần thể lúa ở Jiangxi cĩ mức độđa hình cao hơn ở Hunan.
Yang Xiaquan và cs, 2005 [73] sử dụng 2 chỉ thị genomic-SSR và EST-SSR phân tích 3 lồi lúa mỳ lục bội gồm 28 common wheat (Triticum aestivum L.), 13 spelt (Triticum spelta L.) và 11 compactum (Triticum compactum Host.). Kết quả cho thấy đa hình di truyền của các giống common wheat cao nhất tiếp đến là spelt và compactum. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể cao hơn trong cùng quần thể và xu thế tương tự được khám phá cho các genome A, B và D. Chính vì thế, spelt và compactum cĩ thể sử dụng làm tập đồn giống cho chọn giống lúa mỳđặc biệt là tăng cường gen D. Qua kết quả này một lần nữa nhĩm tác giả khẳng định rằng chỉ thị EST-SSR là chỉ thị lý tưởng đểđánh giá đa dạng di truyền cũng như nghiên cứu nguồn gốc và sự tiến hố cây lúa mỳ.
ðối với cây ăn quả, sử dụng kết hợp kỹ thuật SSR và AFLP phân tích đa dạng di truyền của tập đồn giống bưởi chùm cho thấy gần 99,1% của 335 SSR loci, 72% của 343 AFLP loci là đa hình và 9,85 alen/SSR locus được phát hiện. Giá trịđa dạng di truyền thay đổi từ 0,19 đến 0,91. Tỷ lệ dị hợp tử dao động từ 0,13 đến 0,28. Phân tích sơ đồ hình cây cho thấy tập đồn giống bưởi chùm phân thành 8 nhĩm, gồm một số nhĩm chính như nhĩm bưởi Shatain, Wendan và các giống lai. Kết quả phân loại cho phép mở rộng các giống bưởi này làm genotyp nền để sử dụng cho mục tiêu chọn giống (Liu Yong và cs, 2005) [56].
* Ở Việt Nam
Trong nghiên cứu chọn giống cây trồng, việc xác định cấu trúc di truyền, đánh giá đa hình và phân nhĩm di truyền của quần thể bố mẹ là việc
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………23
làm cần thiết và cĩ ý nghĩa. Ứng dụng chỉ thị phân tử vào cơng tác chọn tạo giống cây trồng là một hướng đi mới tại Việt Nam. Song song với các phương pháp chọn tạo giống truyền thống thì đây được coi là một cơng cụ hữu ích làm tăng hiệu quả và gĩp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống. Tuy nhiên, việc ứng dụng cơng nghệ sinh học nĩi chung và chỉ thị phân tử nĩi riêng trong chọn giống cây trồng ở Việt Nam cịn nhiều hạn chế, phần lớn các kết quảđạt được chỉở mức độ phịng thí nghiệm.
Trong nghiên cứu đa dạng di truyền của 19 dịng/giống lúa bố mẹ và con lai F1 trong sản xuất lúa lai hai dịng bằng chỉ thị phân tử, Nguyễn Văn ðồng và cs, 1999 [7] đã dùng 15 cặp mồi SSR nghiên cứu đa hình. Kết quả thu được cho thấy, mức độ đa hình giữa chúng rất lớn, dao động từ 0,06 – 1,00. Trên cơ sở đĩ tác giảđã lựa chọn và đưa ra tổ hợp lai và TGMS-VN1 x D24 dựđốn cho ưu thế lai cao với khoảng cách di truyền 0,67 – 0,90.
Bùi Mạnh Cường và cs, 2003 [23] đã sử dụng chỉ thị RAPD đánh giá 29 dịng ngơ thuần với 60 mồi ngẫu nhiên. Kết quả cho thấy khoảng cách di truyền biến động từ 0,47 - 0,77 chứng tỏ giữa các vật liệu nghiên cứu cĩ sựđa hình rất lớn. Phân nhĩm ưu thế lai (ƯTL) theo phương pháp PCO (Principal coodinate analysis - Gower, 1966) xác định hai nhĩm chính, tồn tại tương quan tuyến tính dương với r = 0,61 - 0,67 giữa năng suất và GD bố mẹ, xác định được 03 tổ hợp lai cĩ năng suất cao hơn bố mẹ từ 9 - 14%. Tương tự, Bùi Văn Thắng và cs, 2003 [23] sử dụng kỹ thuật RAPD với 11 mồi ngẫu nhiên đánh giá đa dạng di truyền của tập đồn 33 giống lạc chống chịu bệnh gỉ sắt, thu được 109 phân đoạn ADN, trong đĩ cĩ 66 phân đoạn đa hình (chiếm 60,6%) cho thấy cĩ sự khác biệt di truyền từ 4 - 18%. Phân nhĩm theo GD cho thấy các giống cĩ cùng vùng địa lý, sinh thái ở cùng nhĩm; cĩ thể chọn làm các bố mẹ phụ vụ cho cơng tác lai tạo giống.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………24
Sử dụng chỉ thị SSR đánh giá đa dạng di truyền của tập đồn 35 giống lạc cĩ phản ứng khác nhau với bệnh héo xanh vi khuẩn. Lê Thị Muội và cs, 2005 [12] đã sử dụng 20 cặp mồi SSR để đánh giá. Kết quả cho thấy, cĩ 19 cặp mồi cho đa hình, hệ số sai khác di truyền giữa các giống khá lớn, dao động từ 12 – 49%. Kết quảđã ghi nhận các giống lạc cĩ cùng nguồn gốc hoặc cùng mức độ kháng bệnh đều được xếp vào một nhĩm nhỏ.
Ngồi ra, sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu 10 dịng/giống lúa cĩ nguồn gốc khác nhau đã xác định được tương đồng di truyền dao động từ 0,49 - 0,96. Qua kết quả nghiên cứu đã phân loại các giống lúa thành các nhĩm cĩ khoảng cách di truyền khác nhau, đĩ là cơ sở để chọn bố mẹ cho chọn giống lúa lai (Võ Thị Minh Tuyền, 2007) [21].
Trong những năm gần đây, việc sử dụng chỉ thị phân tử ở nước ta tập trung chủ yếu vào các tính trạng kháng sâu bệnh, chống chịu điều kiện bất lợi của mơi trường, các tính trạng chất lượng…
Lưu Ngọc Huyền, 2005 [8] sử dụng 50 cặp mồi SSR xác định tính kháng rầy nâu ở một số dịng/giống lúa. Kết quả đã xác định được 15 chỉ thị SSR nằm ở NST số 4 của hệ gen lúa và sử dụng làm chỉ thị trợ giúp để chọn lọc các cá thể mang gen kháng rầy nâu. Trong khi đĩ, Trương Bá Thảo và cs, 2005 [17] phân tích đa dạng di truyền về tính trạng protein của 50 giống lúa mùa tại 31 loci khác nhau. Các SSR marker cĩ mức độđa hình tốt là RM335, RM272, RM180, RM183. Marker RM234 liên kết với gen điều khiển tính trạng hàm lượng protein (GPC) trong gạo được xác định trên NST số 7. Sự liên kết marker RM234 với gen điều khiển GPC cao biểu hiện độ chính xác 93,3% QTL điều khiển tính trạng này.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………25 2.5.3.2. Một số thành tựu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bơng vải
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của cơng nghệ sinh học, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống bơng đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu.
Theo Liu và cs, 2000 [54] sử dụng 65 cặp mồi để khuếch đại 70 locus trong genome (nhiễm sắc thể) của các lồi bơng. Kết quả nghiên cứu chỉ thị SSR được xác định trong nghiên cứu này đã cung cấp những số liệu cĩ mức độ tin cậy cao là cơ sở cho các nghiên cứu khác. Hơn nữa, cĩ thể sử dụng kết hợp chỉ thị SSR với các chỉ thị khác để lập bản đồ liên kết của genome bơng. Thật vậy, gần đây bản đồ liên kết đã được tạo ra với sự kết hợp sản phẩm của 199 RAPD và SSR trong chọn lọc giống bơng (Ulloa và cs, 2000) [72].
Một số nghiên cứu gần đây khi sử dụng các chỉ thị như RAPD, AFLP và SSR cho thấy mức độđa hình của các lồi bơng trồng tương đối thấp, cĩ thể từ 1 - 3% (Wendel và cs, 1992; Tatineni và cs, 1996; Pilley và Myers, 1999; Lu và Myers, 2002) [75], [69], [63], [57] và 1 - 8% (Multani và Lyon, 1995) [59]. Một số kết quả ở Úc, Trung Quốc và Pakistan cũng cĩ kết quả tương tự (Zuo và cs, 2000; Rahman và cs, 2002) [77], [64]. Tuy nhiên, một số kết quả khác cho thấy mức độ đa hình của các giống bơng khá cao. M. K. Rana và K. V. Bhat, 2005 [66] nghiên cứu 59 giống bơng thuộc 4 lồi bơng trồng cho thấy, đa hình giữa 59 giống bơng đạt 36%. Trong đĩ, mức độ tương đồng di truyền trung bình của 41 giống bơng luồi (Gossypium hirsutum L.) đạt 74%, đồng thời qua nghiên cứu các tác giả đã khẳng định rằng đa hình giữa các lồi bơng nhị bội cao hơn các lồi bơng tứ bội.
Trước đĩ, Rahman và cs, 2002 [64] nghiên cứu đa hình của 27 giống bơng cho mức tương đồng di truyền là 66,2%. Sử dụng đồng thời chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử Tatineni và cs, 1996 [69] đã đánh giá quan hệ di truyền
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………26
của 16 giống bơng nhập nội, khẳng định tương quan tuyến tính dương (r=0,63) giữa khoảng cách di truyền theo chỉ thị RAPD và khoảng cách phân loại theo chỉ thị hình thái. Trong khi đĩ, Ivan Schuster và cs, 2006 [48] sử dụng microsatellites nghiên cứu quan hệ di truyền của 53 giống bơng, cho kết quả tương quan tuyến tính trung bình đạt 0,40 ± 0,01. Một số nghiên cứu khác, Iqbal và cs, 1997 [47] xác định tỷ lệđa hình 89,1% trong 22 giống bơng