Tách chiết ADN là khâu kỹ thuật quan trọng ñầu tiên trong quá trình phân tích ADN. ðể ñảm bảo AND ñạt chất lượng tốt, ñáp ứng ñúng yêu cầu của ñề tài, chúng tôi tiến hành gieo hạt trong khay, thu mẫu lá (lá mầm) của 20 giống bông và tách chiết theo phương pháp CTAB với một số cải tiến.
Kết quả ñiện di sản phẩm ADN trên agarose 1,0% thu ñược hàm lượng ADN khá lớn, sạch, không bị ñứt gãy, các băng rõ nét và ñảm bảo ñủ ñiều kiện ñể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo (hình 4.4 và phụ lục 2).
Kết quả thu ñược một số hình ảnh sau khi ñiện di sản phẩm PCR của 20 giống bông trên agarose 3,0% ñược thể hiện ở phụ lục 4.
Hình 4.5. Kết quảñiện di sản phẩm SSR với cặp mồi BNL1317 trên agarose 3% (giếng 1: marker 1kb; giếng 2-21: thứ tự các giống V1, V15, V2, V3, V5, V4, V13,
V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V14, V17, V16, V18, V19, V20)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Hình 4.4. AND tổng số của các giống thí nghiệm (giếng 1 - 20: ADN các giống bố
mẹ (từ V1ñến V20), giếng 21: Lamda 100ng giếng 2 -1:)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………49
Bảng 4.8. Trình tự, tổng số phân ñoạn nhân ñược và sốñoạn ña hình của các căp mồi nghiên cứu
Ký hiệu Trình tự cặp mồi Tổng số alen ña hình Số alen Tỷ lệ (%)
BNL4059 F-gagttacgcctggcaatcat R-ccatccccagtggtgttatc 2 2 100,0 BNL2569 F-cagagagccattgtgaacga R-ataatgctagggcatgtggc 2 2 100,0 BNL2882 F-caacctttggtaatcttctttcg R-cgctaacgcatttgacatct 2 2 100,0 BNL2590 F-gaaaaaccaaaaaggaaaatcg R-ctccctctctctaaccggct 2 1 50,0 BNL3145 F-ttgttgttgggaatgatgga R-tgacccttcaccgactttct 2 1 50,0 BNL2690 F- taagctctggaggccaaaaa R- ccatttcaatttcaagcatacg 1 0 0,0 BNL2986 F-tagagccaagtggtgatccc R-aaaggggggaatgattatgc 2 1 50,0 BNL3008 F-atctcagatttaaacatataatag R-taaaatgaaggccatcaggc 1 0 0,0 BNL4108 F-tccaccattcccgtaaatgt R-tggccaagtcattaggcttt 2 2 100,0 BNL3359 F-ttgttgttgggaatgatgga R-tgacccttcaccgactttct 2 2 100,0 BNL3955 F-atattttattcttttaatagcttt R-ttggaaaaacccatggtgat 2 2 100,0 BNL3345 F-cgaagcgcgattaagagaac R-aaagcgaagccaacagtctc 2 1 50,0 BNL3902 F-gagtttgggggctgtgtatg R-ggggtgcttatgtcagacgt 2 2 100,0 BNL0686 F-atttttcccttggtggtcct R-acatgatagaaatataaaccaaacacg 2 3 100,0 BNL1317 F-aaaaatcagccaaattggga R-cgtcaacaattgtcccaaga 3 2 66,7
Trong khuôn khổ nghiên cứu của ñề tài, chúng tôi sử dụng 15 cặp mồi (primers) SSR ñể nghiên cứu, ñánh giá ña dạng di truyền các giống bông là BNL 0686, BNL1317, BNL2569, BNL2590, BNL2646, BNL2690,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………50
BNL2882, BNL2986, BNL3008, BNL3145, BNL3345, BNL3359, BNL3902, BNL3955 và BNL4108 (bảng 4.8). Kết quả ñiện di sản phẩm PCR cho thấy, ña số các cặp mồi ñều nhân ñược 2 alen, riêng cặp mồi BNL1317 nhân ñược 3 alen với các kích thước khác nhau (bảng 4.8).
Các alen SSR thu ñược phân tích dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu (xuất hiện băng ADN ñược ký hiệu là 1 và 0 là không xuất hiện). Dựa vào mức ñộña hình của các phân ñoạn ADN mà chúng ta có thểñánh giá mức ñộ khác nhau và giống nhau giữa các mẫu nghiên cứu.
Kết quả sử dụng 15 cặp mồi (primers) SSR ñánh giá ña hình của 20 giống bông cho thấy, tất cả 15 cặp mồi ñều cho xuất hiện băng ADN với kích thước trong khoảng 250 – 450 bp. Trong ñó có 13 cặp mồi cho ña hình (chiếm 86,7%), riêng có 2 cặp mồi là BNL2690 và BNL3008 chỉ cho một alen duy nhất. Kết quả thu ñược tổng số 29 alen/15 locus (mỗi cặp mồi tương ứng với một locus) với giá trị trung bình là 2,0 alen/1 locus. Số lượng alen/1 locus dao ñộng từ 1 ñến 3. Trong 15 locus nghiên cứu có 01 locus BNL1317 ñược phát hiện có số alen lớn nhất là 3 alen/1 locus, 12 locus cho 2 alen/1 locus và 2 locus cho 1 alen duy nhất.