Vật liệu thí nghiệm

Giốngvi khuẩn Bacillussubtilisđượccung cấptừphịng visinhkhoaChăn nuơi ThúytrườngđạihọcNơngLâmTp HồChíMinh.

3.2.2.Mơitrƣờngnuơicấy

 Mơitrườnggiữ giống,đếmsốlượngtếbào:TSA(TrypticaseSoya Agar).  Mơi trường khảo sát đặc điểm sinh học: TSB (Tripticase Soya Broth),

 Cácmơitrườngđềuđươcvơtrùngtrướckhisửdụng.

3.2.3.Hốchất

 Hốchấtcơbản:NaOH1N,HCl 1%,NaCl,…

 Hốchấtdùngkhảosátđặctínhsinhhọccủavikhuẩn:dầusoi,xylen,…  ThuốcthửKowac’s,Methyl-Red,…

 ThuốcnhuộmGram:  Thuốcnhuộmbàotử.

3.2.4.Thiếtbịvàdụngcụ

 Thiếtbị

Kínhhiểnvi,tủấm,tủsấy,nồihấpautoclave,tủlạnh,cânđiệntử,nồicáchthuỷ, microwave…

 Dụng cụ

Đĩa petri,ống nghiệm, bìnhtamgiác, lame, đũa thuỷtinh,pipette, ống Durham, đầutipvơtrùng…

1 7

3.3.Nội dungnghiêncứu

 Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis: hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn, tínhchấtnuơicấytrên mộtsốmơitrường,thửđặctínhsinhhố.

 So sánh phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đỗ đĩa và phươngphápđếmtrên kínhhiểnvi.

 Ảnhhưởngcủahìnhthứcvàthờigiannuơicấyđếnsốlượngtếbàovikhuẩn.  Ảnhhưởngcủamơi trườngvàthờigian nuơicấyđếnsốlượngtếbàovikhuẩn.

3.4.Phƣơngpháp thựchiệnđềtài

3.4.1.Khảosátđặcđiểmsinhhọccủa Bacillussubtilis

 QuansátđặcđiểmhìnhtháicủaBacillussubtilis

VikhuẩnBacillussubtilisđượcnuơitrongmơi trườngthạchnghiêngTSA . Sau24giờđemnhuộm Gram vàxemdưới kínhhiểnvi ởđộphĩng đại1000 lần (XemphươngphápnhuộmGramởphầnphụlục).

 Quansátđặcđiểmnhĩmcủa Bacillussubtilis

Phânphối15mlmơi trườngTSAđãđượchấptiệttrùngvàođĩapetrivơtrùngrồi đểnguội. Hồ vikhuẩn vào nước muối sinhlí đãđược hấptiệt trùng,lấy10dịch pha

lỗngtranglên mơitrườngđểtạokhuẩnlạcđơncủavikhuẩnBacillussubtilis.Sauđĩ, gĩiđĩapetrivàủỏnhiệtđộ37oCtrong24giờ.

Quansátđặcđiểmnuơicấycủa Bacillussubtilis trongmơitrƣờngcanh

MơitrườngTSBđượcphân phối4-5 mlvàoốngnghiệmvơtrùng,đemhấptiệt trùngvàlàmnguội.Cấygiốngvikhuẩn vàomơitrườngvàủ ởnhiệtđộ 37oCtrong24 giờ.Sauđĩquansátvàxemsựthayđổicủamơitrườngnuơi cấy.

3.4.2.CácthínghiệmvềBacillussubtilis

3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ nuơi cấy (nuơi cấy tĩnh, nuơi cấy lắc) và thời giannuơicấyđếnsốlƣợngvikhuẩn

 Nguyêntắc

Khi nuơi cấy vi sinh vật trong cùng một loại mơi trường nhưng khác nhau về thời gian và chế độ nuơi cấy (Nuơi cấy tĩnh và nuơi cấylắc) thì cho lượng sinh khối khácnhau.

 Mụcđích

Xácđịnhsốlượngvikhuẩnởthờigian vàchếđộnuơi cấynàolàphùhợp.

1 8

Bảng3.1.Bốtríthínghiệm1

Thờigian Mơitrường

Nuơicấytĩnh Nuơicấylắc 24h

36h 48h

 Cách làm

Cấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ ống giống vào ống nghiệm chứa 4 - 5 ml mơi trường TSB đã được hấp tiệt trùng (121oC/15 phút), đem đi ủ ở 37oC trong24giờ.

Sau đĩ, cấy vi khuẩn từ ống nghiệm vào bình tam giác chứa 50ml mơi trường TSBvớitỉlệ2%,nuơicấytrong2chếđộkhácnhau:nuơicấytĩnhvànuơicấylắc(lắc 15phút,nghỉ45phút) ởđiềukiện37oC.

Kiểm trasố lượng vikhuẩn sau thời gian 24, 36, 48giờ bằngphươngpháp đếm khuẩnlạc.

Từ khảo sát trên chúng tơi chọn được chế độ nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtiis

thíchhợpđểtiếptụckhảosátthinghiệmtiếptheo.

3.4.2.2. Khảo sát mơi trƣờng và thời gian nuơi cấy thích hợp cho vi khuẩn

Bacillussubtilis pháttriểntạosinhkhối

 Nguyêntắc

Khi nuơi cấyvikhuẩn trongcácloại mơi trườngkhác nhau ởđiều kiệnnuơi cấy giốngnhau(pH,nhiệtđộ,thờigiannuơi cấy)thìsốlượngvikhuẩnsẽkhácnhau.

 Mụcđích

Xácđịnhmơitrườngnuơi cấynàolàthíchhợp.  Cách làm

Cấyvi khuẩn từốnggiốngvàoống nghiệmchứa 4 – 5ml mơi trườngTSB,ủ ở 37oCtrong24giờ.

1 9

Sauđĩ, chuyển vikhuẩn từ ốngnghiệmvào 4loại mơi trườngkhác nhau: TSB, TSB +1% glucose, TSB+ 1% caonấmmen, TSB+ 1% glucose + 1%cao nấmmen (vớitỉlệ2%).

Sauđĩ đemnuơicấyởchếđộ đãđược chọnratừthínghiệm 1,đếm sốlượngvi khuẩnsau24,36,48giờnuơicấybằngphươngphápđếmkhuẩnlạc.

Từkhảosáttrên chúngtơichọnđượcloạimơi trườngnuơicấythích hợpđể tiếp tụckhảosátthínghiệmtiếptheo.

Bảng3.2.Bốtríthínghiệm2

Mơitrường Thờigian

(giờ) TSB TSB+1%Glucose TSB+1%Caonấmmen TSB+1%Glucose+

1%Caonấmmen 24

36 48

3.4.2.3. KhảosátpH,mơitrƣờngthích hợp nuơicấyvikhuẩnBacillussubtilis

 Nguyêntắc

Mỗi loại vi khuẩn thích hợp với một độ pH khác nhau, vì vậy khi nuơi cấy vi khuẩn trong cùngmột loại mơi trường nhưng ở các độ pH khác nhau thì số lượng vi khuẩnphát triểnsaucùng mộtkhoảngthờigianlàkhácnhau.

Bảng3.3.Bốtríthínghiệm4 Thờigian (giờ) 24 36 48 pH 7,0 7,5 Nhiệtđộphịng 37oC Nhiệtđộphịng 37oC 2 0  Mụcđích

XácđịnhpHmơitrườngnuơicấythíchhợp.  Cáchlàm

Cấyvi khuẩn từ ống giốngvào ống nghiệm chứa 4 -5 ml mơi trườngTSB, ủ ở 37oCtrong24giờ.

Sauđĩ, chuyểnvikhuẩntừốngnghiệmvàomơitrường đượcchọntừthínghiệm 2ởcácpHkhác nhauvớitỉlệ2%vànuơicấyởchếđộnuơicấy(1).

Sau48giờđếmsốlượngvikhuẩnbằngphươngphápđếmkhuẩnlạc.

Từ thí nghiệm chúng tơi chọn ra pH mơi trường nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilisthíchhợp.

3.4.3.CácthínghiệmvềbàotửBacillussubtilis

3.4.3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillussubtilis

 Cáchlàm

Cấyvikhuẩn từơnggiốngvàoống nghiệmchứa 4 – 5ml mơi trườngTSB,ủ ở 37oCtrong24giờ.

Sauđĩ,chuyểnvikhuẩnvàomơitrườngđãđượcchọntừcácthínghiệmtrên. Sauthờigiannuơicấythíchhợp chúngtơixửlínhiệtđộ.

Xử lí ở 50oC và 70oC, đếm số lượng bào tử hìnhthành sau 3, 5, 7 giờ xử bằng phươngphápđếmkhuẩnlạc(xemphầnphụlục)

Bảng3.4. Bốtríthínghiệm4 Thờigian (giờ) 3 5 7 Nhiệt độ 50oC 70oC 2 1

3.4.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sự tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis

 Cáchlàm

Cấyvikhuẩn từống giốngvàoốngnghiệm chứa4 – 5ml mơi trườngTSB, ủở 37oCtrong24giờ.

Sauđĩ,chuyểnvikhuẩnvàomơi trườngđãđượcchọntừcácthínghiệmtrên. Sauthờigiannuơi cấythíchhợpchúngtơixửlípH.

Đếm số lượng bào tử hình thành sau 3, 5, 7 giờ xử lí bằng phương pháp đếm khuẩnlạc. Bảng3.5:Bốtríthínghiệm5 Thờigian (giờ) 3 5 7 pH 6 9 2 2

PHẦN4:KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN

4.1Khảo sátđặcđiểmsinhhọccủa Bacillussubtilis

4.1.1.Đặcđiểmhìnhtháicủa Bacillussutilis

Saukhitiêubảnvikhuẩn đượcnhuộmGramvàđượcquansáttrênkínhhiểnviở độphĩngđại1000lần,chúngtơinhậnthấyvikhuẩnBacillussubtilislà:

 Trựckhuẩnbắtmàu Gramdương,ngắn vànhỏ.

 Kích thước từ 0,5 - 0,8 µm x 1,5 -3 µm, hai đầu trịn, đơi khi nối thành chuỗidài,cĩtạobàotửkhơnglàmphìnhtếbào.

Hình4.1.Tếbàovikhuẩn B. subtilis dƣớikínhhiểnviởđộphĩngđại1000lần

: www.answers.com/ topic/bacillus-1 4.1.2.Quansátđặcđiểmkhuẩnlạccủa Bacillussubtilis

Vi khuẩn được cấy trên mơi trường TSA, sau 24 giờ cho thấy hình dạng của khuẩnlạc:khuẩnlạckhơ,cĩmàuxám nhạttrắng,tạoralớp màngmịn,lantrênbềmặt thạch,cĩmépnhăn,méplồilõm,bámchặtvàomơitrườngthạch.

2 3

4.1.3.Quansátdăc điểmnuơicấy Bacillussubtilis trênmơitrƣờng canh

SaukhicấyvikhuẩnBacillussubtilisvàomơitrườngcanhTSB,đemủở37oC:  Sau12giờ thìvikhuẩnlàmđụcmơitrường.

 Nuơicấyđến24giờthìthấyvikhuẩntạovángtrểnbềmặtcủamơi trường vàlàmchomơitrườngởphíadướitronghơn.

4.1.3.Tínhchấtsinhhố

Bảng4.1.CácphảnứngsinhhốkháccủaBacillussubtilis

Thửnghiệm Kếtquả Hoạttínhcatalase + SinhIndol - MR + VP + Sửdụngcitrate + Khử Nitrate + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose +

Ghichú:(-)làkếtquảâmtính (+)làkếtquảdươngtính

Quabảngchothấykếtquảkhảosátcủachúngtơiphùhợpvới tínhchấtsinhhố củaBacillussubtilis(NguyễnVĩnhPhước,1976).

Ngồi rachung tơi cịnkhảo sátthấyđược rằng Bacillus subtilis cĩkhả năngsử dụngcácchấtnhư:glucose,citrate,hợpchấtchứanitrogenvàcĩkhảnăngdiđộng.

tryptophantạoIndol.

2 4

Hình4.4. Phảnứnglênmenmộtsốloạiđƣờngcủavikhuẩn Bacillussubtilis

 Khảnăngphângiảitinhbột

Chúng tơiđã tiến hành khảo sát khảnăng sử dụngtinh bột bằngcách đođường kínhvịngphân giảitrên mơi trường thạch tinh bột (Starch agar) và thuđược kếtquả đườngkínhvịngphângiảitrungbìnhlà2,9cm.

Hình4.3. KhuẩnlạcBacillussubtilis trênmơitrƣờngthạchtinhbột.

4.2.Cácthínghiệmvề Bacillussubtilis

4.2.1.Khảosátchếđộ(nuơicấytĩnh,lắc)vàthờigiannuơicấythíchhợp

Chúngtơitiếnhành:

 NuơicấyvikhuẩntrongmơitrườngTSBởhaichếđộnuơicấykhácnhau: nuơicấytĩnhvànuơicấylắc(15phútlắc,45phútnghỉ).

 Đếmsố lượngvi khuẩn ở3 thời điểm:24giờ, 36giờ, 48giờ bằngphương phápđỗđĩa(thí nghiệmđượclặplại2lần).

2 5

Bảng4.1.Ảnhhƣởngcủathờigianvàchếđộnuơicấy đếnsốlƣợng vikhuẩn Bacillussubtilis

Thờigian (giờ)

Chếđộnuơicấy

Nuơicấylắc Nuơicấytĩnh

12 10,15 8,79

18 11,07 9,92

24 11,16 9,95

X 10,79 9,55

(Sốlượngvikhuẩn/mltínhtheologarit)

Số lƣợng vi khuẩn (tính the o logarit) 12 10 8 6 4 2 0

12 18 24 Thời gian (giờ)

Nuơi cấy lắc Nuơi cấy tĩnh

Biểuđồ4.1Ảnhhƣởngcủachế độvàthờigiannuơicấy đếnsốlƣợng vikhuẩn B.subtilis

Qua kết quả ở bảng 4.1 chothấy số lượng vi khuẩn trung bình trong1 ml canh khuẩn ởchế độ nuơi cấylắc là10,79 (giá trị logarit) (sốthựctế là 6,17.1010)cao hơn so với số lượng vi khuẩn trung bình ở chế độ nuơi cấy tĩnh 9,55 (giá trị logarit) (sốthựctếlà35,48.108).

Kếtquả xử lí thốngkê chothấy rằngcĩ sự khác biệtvề số lượng vi khuẩn giữa hai chế độ nuơi cấy tĩnh và lắc, sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (với

phân bố đồng đều hơn trong mơi trường giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh hơn khi 2 6

nuơicấytĩnh(vìBacillussubtilislàvikhuẩn hiếukhínênkhicung cấpnhiềuoxyhơn thìchúngsinhsảnvàpháttriểnmạnhhơn).

Kếtquả xửlí thốngkê cũngcho thấyrằngcĩ sựkhác biệt về sốlượng vikhuẩn giữacáckhoảngthờigiannuơicấy(12giờ,18giờvà24giờ)(vớiP<0,05).

Qua bảng kết quả, khi nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis sau 24 giờ ở chế độ nuơi cấy lắc thì cho số lượng tế bào vi khuẩn là 11,16 (giá trị logarit) cao hơn ởcác mứcthờigian 12giờ,18giờ(10,15;11,07).

Vì vậy, chúng tơi quyết định chọn chế độ nuơi cấy lắc để khảo sát số lương vi khuẩntrongcácloạimơitrườngnuơi cấykhácnhauởthínghiệmtiếptheo.

4.2.2.Khảosátmơitrƣờngvàthờigiannuơicấythíchhợp

Từ kết quả củathí nghiệm 1, chúng tơi tiến hành nuơi cấyđể xácđịnh số lượng vikhuẩntrên4loạimơitrường:

 TSB.

 TSB+1%glucose.  TSB+1%caonấmmen.

 TSB+1%glucose+1%caonấmmen.

Ởđiềukiện37oC,nuơi cấylắc(15phútlắc,45phútnghỉ)vớitỉlệgiống 2%. Đếmsố lượng vi khuẩn bằng phươngpháp đỗ đĩa vào cácthời điểm: 24giờ, 36 giờvà48giờ(thínghiệmđượclặplại2lần).

KếtquảthínghiệmđượctrìnhbàyquaBảng4.2vàBiểuđồ4.2.

Bảng4.2.Ảnhhƣởngcủamơitrƣờngvàthờigiannuơicấyđếnsốlƣợngvi khuẩn Bacillussubtilis

Thờigian (giờ) Mơi trường TSB TSB+1%glucose TSB+1% caonấmmen TSB+1%glucose+ 1%caonấmmen X 24 11,08 11,25 11,32 11,28 11,23

36 11,19 11,36 11,40 11,37 11,33

48 11,30 11,44 11,49 11,46

11,43

X 11,19 11,35 11,4 11,37

(Sốlượngvikhuẩn/mltínhtheologarit)

2 7 Số lƣợng vi khuẩn (Tính theo logarit) 14 12 10 8 6 4 2 0 24 36

48 Thời gian (giờ)

TSB TSB+1%glucose

TSB+1%caonấmmen TSB+1%glucose+1%caonấmmen

Biểuđồ4.2.Ảnhhƣởngcủathờigianvàmơitrƣờngnuơicấyđếnsốlƣợng vikhuẩn Bacillussubtilis

Qua kết quả trình bày ở Bảng 4.2 cho thấy số lượng vi khuẩn trungbình trong 1ml canh khuẩn của mơi trường TSB + 1% cao nấm men là 11,4 (giá trị logarit) (sốthựctế là25,19.1010)caohơnsố lượngvikhuẩn trungbìnhtrong 1mlcanh khuẩn của các mơi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Và số lượng vi khuẩn trung bình ở thời gian nuơi cấy 48 giờ là 11,43 (giá trị logarit) (số thực tế 26,6.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩnkhinuơicấyởcácmứcthờigiankhác.

Kết quả xử lí thống kê cho thấy khơng cĩ sự khác biệt giữa 3 loại mơi trường TSB,TSB+1%glucosevàTSB+1%glucose+1%caonấmmen.Nhưngcĩsựkhác biệtgiữamơitrườngTSBvới3loạimơi trườngtrên.

cáckhoảngthờigiannuơicấy(24giờ,36giờ và48giờ)với (P<0,05).

Từkếtquảtrên,chúng tơichọnmơi trườngTSB+ 1%caonấmmenvàthờigian nuơicấy48giờđểkhảosátcácthínghiệmtiếptheo.

4.2.3.KhảosátpH,thờigianvànhiệtđộnuơicấyvikhuẩnthích

Từ kếtquảcủacácthínghiệm1 và2, chúngtơitiếnhànhnuơi cấyvikhuẩn trên mơitrườngTSB+1%caonấmmen ở2mứcpH(7và7,5)trong điềukiện37oC, nuơi cấylắc(15phútlắc,45phútnghỉ) vớitỉlệcấygiống2%(thínghiệmlặplại2lần).

2 8

Đếmsốlượngvikhuẩnsauthờigiannuơi cấybằngphươngphápđỗđĩa.Kếtquả đượctrình bàyởBảng4.3.

Bảng4.3.ẢnhhƣởngcủapH,nhiệtđộvàthờigiannuơicấyđếnsốlƣợng vikhuẩn Bacillussubtilis

Thờigian (giờ) pH 7,0 7,5 Nhiệtđộphịng 37oC Nhiệtđộphịng 37oC 24 10,83 11,37 10,85 11,25 36 10,96 11,45 10,92 11,33 48 11,05 11,54 11,00 11,40 X 10,95 11,45 10,93 11,33

(Sốlượngvikhuẩn/mltínhtheo logarit)

QuakếtquảBảng4.3chothấysốlượngvikhuẩntrungbìnhtrong1mlcanh khuẩnởpH=7vànhiệtđộ37oClà11,45(giátrịlogarit)(giátrịthựctế28,18.1010) caohơnsốlượngvikhuẩntrungbìnhởcácđiềukiệnkhác (pH=7ởnhiệtđộphịng, pH=7,5ởnhiệtđộphịngvàpH=7,5ở37oC).

Quakếtquảxửlýthốngkêchothấycĩsựkhácbiệtgiữacácđiềukiệnnuơicấy trên,sựkhácbiệtnàycĩýnghĩavềmặtthốngkê(P<0,05).

Sốlƣợngvi khuẩn (tínhtheo logarit) 14 12 10

8 6 4

2 0

24 36 48 Thờigian(giờ)

pH 7, nhđộ phịng pH 7, 37 độ C pH 7.5, nhđộ phịng pH

7.5, 37 độ C

Biểuđồ4.3.ẢnhhƣởngcủapH,nhiệtđộvàthờigiannuơicấy đếnsốlƣợng vikhuẩn Bacillussubtilis

2 9

Kếtquảxửlýthốngkêcũngchothấyrằngcĩsựkhácbiệtvềsốlượngvikhuẩn giữacáckhoảngthờigiannuơicấy(24giờ,36giờvà48giờ)(P<0,05).Vậykhinuơi cấyvikhuẩn Bacillussubtilistrongmơi trườngcĩpH=7,ởnhiệtđộ37oCtrong24 giờchosốlượngtếbàovikhuẩncaonhất.

4.2.4.CácthínghiệmvềbàotửBacillussubtilis

4.2.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của

Bacillussubtilis

Từ kết quả của các thí nghiệm 1, 2 và 3,chúng tơi tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trên mơitrườngTSB+ 1%caonấmmen,pH=7, ởtrong điềukiện37oC,nuơicấylắc