Saukhitiêubảnvikhuẩn đượcnhuộmGramvàđượcquansáttrênkínhhiểnviở độphĩngđại1000lần,chúngtơinhậnthấyvikhuẩnBacillussubtilislà:
Trựckhuẩnbắtmàu Gramdương,ngắn vànhỏ.
Kích thước từ 0,5 - 0,8 µm x 1,5 -3 µm, hai đầu trịn, đơi khi nối thành chuỗidài,cĩtạobàotửkhơnglàmphìnhtếbào.
Hình4.1.Tếbàovikhuẩn B. subtilis dƣớikínhhiểnviởđộphĩngđại1000lần
: www.answers.com/ topic/bacillus-1 4.1.2.Quansátđặcđiểmkhuẩnlạccủa Bacillussubtilis
Vi khuẩn được cấy trên mơi trường TSA, sau 24 giờ cho thấy hình dạng của khuẩnlạc:khuẩnlạckhơ,cĩmàuxám nhạttrắng,tạoralớp màngmịn,lantrênbềmặt thạch,cĩmépnhăn,méplồilõm,bámchặtvàomơitrườngthạch.
2 3
4.1.3.Quansátdăc điểmnuơicấy Bacillussubtilis trênmơitrƣờng canh
SaukhicấyvikhuẩnBacillussubtilisvàomơitrườngcanhTSB,đemủở37oC: Sau12giờ thìvikhuẩnlàmđụcmơitrường.
Nuơicấyđến24giờthìthấyvikhuẩntạovángtrểnbềmặtcủamơi trường vàlàmchomơitrườngởphíadướitronghơn.
4.1.3.Tínhchấtsinhhố
Bảng4.1.CácphảnứngsinhhốkháccủaBacillussubtilis
Thửnghiệm Kếtquả Hoạttínhcatalase + SinhIndol - MR + VP + Sửdụngcitrate + Khử Nitrate + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose +
Ghichú:(-)làkếtquảâmtính (+)làkếtquảdươngtính
Quabảngchothấykếtquảkhảosátcủachúngtơiphùhợpvới tínhchấtsinhhố củaBacillussubtilis(NguyễnVĩnhPhước,1976).
Ngồi rachung tơi cịnkhảo sátthấyđược rằng Bacillus subtilis cĩkhả năngsử dụngcácchấtnhư:glucose,citrate,hợpchấtchứanitrogenvàcĩkhảnăngdiđộng.
tryptophantạoIndol.
2 4
Hình4.4. Phảnứnglênmenmộtsốloạiđƣờngcủavikhuẩn Bacillussubtilis
Khảnăngphângiảitinhbột
Chúng tơiđã tiến hành khảo sát khảnăng sử dụngtinh bột bằngcách đođường kínhvịngphân giảitrên mơi trường thạch tinh bột (Starch agar) và thuđược kếtquả đườngkínhvịngphângiảitrungbìnhlà2,9cm.
Hình4.3. KhuẩnlạcBacillussubtilis trênmơitrƣờngthạchtinhbột.
4.2.Cácthínghiệmvề Bacillussubtilis
4.2.1.Khảosátchếđộ(nuơicấytĩnh,lắc)vàthờigiannuơicấythíchhợp
Chúngtơitiếnhành:
NuơicấyvikhuẩntrongmơitrườngTSBởhaichếđộnuơicấykhácnhau: nuơicấytĩnhvànuơicấylắc(15phútlắc,45phútnghỉ).
Đếmsố lượngvi khuẩn ở3 thời điểm:24giờ, 36giờ, 48giờ bằngphương phápđỗđĩa(thí nghiệmđượclặplại2lần).
2 5
Bảng4.1.Ảnhhƣởngcủathờigianvàchếđộnuơicấy đếnsốlƣợng vikhuẩn Bacillussubtilis
Thờigian (giờ)
Chếđộnuơicấy
Nuơicấylắc Nuơicấytĩnh
12 10,15 8,79
18 11,07 9,92
24 11,16 9,95
X 10,79 9,55
(Sốlượngvikhuẩn/mltínhtheologarit)
Số lƣợng vi khuẩn (tính the o logarit) 12 10 8 6 4 2 0
12 18 24 Thời gian (giờ)
Nuơi cấy lắc Nuơi cấy tĩnh
Biểuđồ4.1Ảnhhƣởngcủachế độvàthờigiannuơicấy đếnsốlƣợng vikhuẩn B.subtilis
Qua kết quả ở bảng 4.1 chothấy số lượng vi khuẩn trung bình trong1 ml canh khuẩn ởchế độ nuơi cấylắc là10,79 (giá trị logarit) (sốthựctế là 6,17.1010)cao hơn so với số lượng vi khuẩn trung bình ở chế độ nuơi cấy tĩnh 9,55 (giá trị logarit) (sốthựctếlà35,48.108).
Kếtquả xử lí thốngkê chothấy rằngcĩ sự khác biệtvề số lượng vi khuẩn giữa hai chế độ nuơi cấy tĩnh và lắc, sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (với
phân bố đồng đều hơn trong mơi trường giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh hơn khi 2 6
nuơicấytĩnh(vìBacillussubtilislàvikhuẩn hiếukhínênkhicung cấpnhiềuoxyhơn thìchúngsinhsảnvàpháttriểnmạnhhơn).
Kếtquả xửlí thốngkê cũngcho thấyrằngcĩ sựkhác biệt về sốlượng vikhuẩn giữacáckhoảngthờigiannuơicấy(12giờ,18giờvà24giờ)(vớiP<0,05).
Qua bảng kết quả, khi nuơi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis sau 24 giờ ở chế độ nuơi cấy lắc thì cho số lượng tế bào vi khuẩn là 11,16 (giá trị logarit) cao hơn ởcác mứcthờigian 12giờ,18giờ(10,15;11,07).
Vì vậy, chúng tơi quyết định chọn chế độ nuơi cấy lắc để khảo sát số lương vi khuẩntrongcácloạimơitrườngnuơi cấykhácnhauởthínghiệmtiếptheo.
4.2.2.Khảosátmơitrƣờngvàthờigiannuơicấythíchhợp
Từ kết quả củathí nghiệm 1, chúng tơi tiến hành nuơi cấyđể xácđịnh số lượng vikhuẩntrên4loạimơitrường:
TSB.
TSB+1%glucose. TSB+1%caonấmmen.
TSB+1%glucose+1%caonấmmen.
Ởđiềukiện37oC,nuơi cấylắc(15phútlắc,45phútnghỉ)vớitỉlệgiống 2%. Đếmsố lượng vi khuẩn bằng phươngpháp đỗ đĩa vào cácthời điểm: 24giờ, 36 giờvà48giờ(thínghiệmđượclặplại2lần).
KếtquảthínghiệmđượctrìnhbàyquaBảng4.2vàBiểuđồ4.2.
Bảng4.2.Ảnhhƣởngcủamơitrƣờngvàthờigiannuơicấyđếnsốlƣợngvi khuẩn Bacillussubtilis
Thờigian (giờ) Mơi trường TSB TSB+1%glucose TSB+1% caonấmmen TSB+1%glucose+ 1%caonấmmen X 24 11,08 11,25 11,32 11,28 11,23
36 11,19 11,36 11,40 11,37 11,33
48 11,30 11,44 11,49 11,46
11,43
X 11,19 11,35 11,4 11,37
(Sốlượngvikhuẩn/mltínhtheologarit)
2 7 Số lƣợng vi khuẩn (Tính theo logarit) 14 12 10 8 6 4 2 0 24 36
48 Thời gian (giờ)
TSB TSB+1%glucose
TSB+1%caonấmmen TSB+1%glucose+1%caonấmmen
Biểuđồ4.2.Ảnhhƣởngcủathờigianvàmơitrƣờngnuơicấyđếnsốlƣợng vikhuẩn Bacillussubtilis
Qua kết quả trình bày ở Bảng 4.2 cho thấy số lượng vi khuẩn trungbình trong 1ml canh khuẩn của mơi trường TSB + 1% cao nấm men là 11,4 (giá trị logarit) (sốthựctế là25,19.1010)caohơnsố lượngvikhuẩn trungbìnhtrong 1mlcanh khuẩn của các mơi trường TSB, TSB + 1% glucose và TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men. Và số lượng vi khuẩn trung bình ở thời gian nuơi cấy 48 giờ là 11,43 (giá trị logarit) (số thực tế 26,6.1010) cao hơn số lượng vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩnkhinuơicấyởcácmứcthờigiankhác.
Kết quả xử lí thống kê cho thấy khơng cĩ sự khác biệt giữa 3 loại mơi trường TSB,TSB+1%glucosevàTSB+1%glucose+1%caonấmmen.Nhưngcĩsựkhác biệtgiữamơitrườngTSBvới3loạimơi trườngtrên.
cáckhoảngthờigiannuơicấy(24giờ,36giờ và48giờ)với (P<0,05).
Từkếtquảtrên,chúng tơichọnmơi trườngTSB+ 1%caonấmmenvàthờigian nuơicấy48giờđểkhảosátcácthínghiệmtiếptheo.
4.2.3.KhảosátpH,thờigianvànhiệtđộnuơicấyvikhuẩnthích
Từ kếtquảcủacácthínghiệm1 và2, chúngtơitiếnhànhnuơi cấyvikhuẩn trên mơitrườngTSB+1%caonấmmen ở2mứcpH(7và7,5)trong điềukiện37oC, nuơi cấylắc(15phútlắc,45phútnghỉ) vớitỉlệcấygiống2%(thínghiệmlặplại2lần).
2 8
Đếmsốlượngvikhuẩnsauthờigiannuơi cấybằngphươngphápđỗđĩa.Kếtquả đượctrình bàyởBảng4.3.
Bảng4.3.ẢnhhƣởngcủapH,nhiệtđộvàthờigiannuơicấyđếnsốlƣợng vikhuẩn Bacillussubtilis
Thờigian (giờ) pH 7,0 7,5 Nhiệtđộphịng 37oC Nhiệtđộphịng 37oC 24 10,83 11,37 10,85 11,25 36 10,96 11,45 10,92 11,33 48 11,05 11,54 11,00 11,40 X 10,95 11,45 10,93 11,33
(Sốlượngvikhuẩn/mltínhtheo logarit)
QuakếtquảBảng4.3chothấysốlượngvikhuẩntrungbìnhtrong1mlcanh khuẩnởpH=7vànhiệtđộ37oClà11,45(giátrịlogarit)(giátrịthựctế28,18.1010) caohơnsốlượngvikhuẩntrungbìnhởcácđiềukiệnkhác (pH=7ởnhiệtđộphịng, pH=7,5ởnhiệtđộphịngvàpH=7,5ở37oC).
Quakếtquảxửlýthốngkêchothấycĩsựkhácbiệtgiữacácđiềukiệnnuơicấy trên,sựkhácbiệtnàycĩýnghĩavềmặtthốngkê(P<0,05).
Sốlƣợngvi khuẩn (tínhtheo logarit) 14 12 10
8 6 4
2 0
24 36 48 Thờigian(giờ)
pH 7, nhđộ phịng pH 7, 37 độ C pH 7.5, nhđộ phịng pH
7.5, 37 độ C
Biểuđồ4.3.ẢnhhƣởngcủapH,nhiệtđộvàthờigiannuơicấy đếnsốlƣợng vikhuẩn Bacillussubtilis
2 9
Kếtquảxửlýthốngkêcũngchothấyrằngcĩsựkhácbiệtvềsốlượngvikhuẩn giữacáckhoảngthờigiannuơicấy(24giờ,36giờvà48giờ)(P<0,05).Vậykhinuơi cấyvikhuẩn Bacillussubtilistrongmơi trườngcĩpH=7,ởnhiệtđộ37oCtrong24 giờchosốlượngtếbàovikhuẩncaonhất.
4.2.4.CácthínghiệmvềbàotửBacillussubtilis
4.2.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của
Bacillussubtilis
Từ kết quả của các thí nghiệm 1, 2 và 3,chúng tơi tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trên mơitrườngTSB+ 1%caonấmmen,pH=7, ởtrong điềukiện37oC,nuơicấylắc (15phútlắc,45phútnghỉ),thờigian nuơicấylà48giờ.
Sau48giờnuơi cấy,chúngtơitiếnhànhxửlínhiệtđộ(50oCvà70oC).
Lần lượt đếm số lượng bào tử vi khuẩn hình thành sau 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ xử lí bằngphươngphápđếmkhuẩnlạc(thínghiệmđượclặplại2lần).
KếtquảđượctrìnhbàyởBảng 4.4vàBiểuđồ4.4.
Bảng4.4.Ảnhhƣởngcủanhiệtđộđếnsựhìnhthànhbàotử vikhuẩn B.subtilis
Thờigian (giờ) Nhiệtđộ(oC) 37 50 70 X 0 5,65 5,65 5,65 5,65 3 5,81 5,9 5,92 5,87 5 6,37 6,97 6,85 6,73 7 7,12 8,75 8,81 8,23 X 6,22 6,82 6,81
(Sốlượngvikhuẩn/mltínhtheologarit)
QuakếtquảcủachúngtơiđượctrìnhbàyởBảng 4.4,sốlượngbàotửhìnhthành trungbìnhtrong 1mlcanh khuẩnsaukhixửlí50oClà6,82 (giátrịlogarit)(sốthựctế là6,6.106 bào tử/1ml) caohơn sốlượng bàotử hìnhthành trung bìnhtrong1 ml canh khuẩnsaukhixửlí70oCvàđốichứng(37oC).
Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy cĩ sự khác biệt khi xử lý nhiệt độ (50oC, 70oC)so với khơng xử lý (37oC)và sự khác biệt nàycĩ ýnghĩa vềmặt thống kê(P< 0,05). Tuy nhiên, kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy khi xử lý nhiệt độ 50oC và 70oCthìsựkhác biệtkhơngcĩýnghĩa(P>0,05).
3 0 Số lƣợng vi khuẩn (tính the o logarit) 10 8 6 4 2 0
0 3 5 Thời gian (giờ)
37 độC 50 độC 70 độC
Biểuđồ4.4.Ảnhhƣởngcủa nhiệtđộđếnsựhìnhthànhbàotửcủa vikhuẩnB. subtilis
QuaBảng4.4cũngthấyđược sốlượngbàotửhìnhthành tăngdầnquathờigian xử lí, số lượng bào tử trung bình sau 7 giờ xử lí là 8,81 (giá trị logarit) (số thực tế 64,5.107) caohơn số lượngbào tửtrungbình ở3 giờ và5 giờ xử lí nhiệtđộ.Kết quả xửlíthốngkêchothấycĩsựkhác biệtgiữacáckhoảng thờigianxửlínhiệtđộ(3giờ, 5giờvà7giờ),sựkhácbiệtnàycĩýnghĩavềmặtthốngkê(P<0.05)
Từkếtquảcủathínghiệm,chúng tơithấyrằngkhixửlýnhiệtđộ(50oC,70oC)cĩ ảnhhưởngđếnsựhìnhthànhbàotửtheo thờigian.Cĩthể, dothờigian xửlýnhiệtđộ vàtheodõingắnnênkhơngthấyđượcsựtácđộngkhácnhaucủa2mứcnhiệtđộnày.
4.2.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn
Bacillussubtilis
Chúngtơitiếnhànhnuơi cấyvikhuẩn trên mơi trườngTSB+1%caonấmmen, pH=7,ởtrongđiềukiện37oC,nuơi cấylắc(15phútlắc,45phútnghỉ),nuơicấytrong thờigian 48giờ.
Sau48giờnuơicấy,chúngtơitiếnhànhxửlípH(pH=6vàpH=9).
Lần lượt đếm số lượng bào tử vi khuẩn hình thành sau 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ xử lí bằngphươngphápđếmkhuẩnlạc.
3 1
Bảng4.5:ẢnhhƣởngcủapHđếnsựhìnhthànhbàotửcủavikhuẩn B.subtilis
Thờigian (giờ) pH 7 6 9 X 0 5,49 5,49 5,49 5,49 3 5,9 6,03 5,99 5,97 5 6,17 6,75 6,9 6,61 7 6,98 8,41 8,35 7,91 X 6,14 6,78 6,68
(Sốlượngvikhuẩn/mltínhtheologarit)
QuakếtquảBảng4.5,chothấysốlượngbàotửhìnhthànhtrung bìnhtrong1ml canh khuẩn sau khi xử lí pH = 6 là 6,78 (giá trị logarit) (số thực tế là 6,03.106 bào tử/1ml)caohơnsaukhixửlípH=9vàđốichứng(pH=7).
Kếtquảxửlýthốngkêchothấycĩsựkhácbiệtcĩý nghĩavềmặtthốngkêgiữa việcxửlýpHvàkhơngxửlýpHđếnsựhìnhthànhbàotử.Nhưng khixửlýpH=6và pH=9thìlạicĩsựkhácbiệtkhơngcĩýnghĩavềmặtthốngkê(P>0,05).
Bảng kếtquả cũngcho thấy số lượng bào tử vi khuẩn hình thành tăng dầntheo thờigian, sốlượngbào tửhìnhthànhtrungbìnhsau7giờ xửlílà7,91 (giá trịlogarit) (sốthực tếlà8,13.107)caohơn sốlượngbàotử trungbìnhở3và 5giờ xửlí. Quakết quảxửlíthốngcũngchothấycĩsựkhácbiệtcĩýnghĩavềmặtthốngkêgiữacácmức thờigianxủlípH(3giờ,5giờ và7giờ).
pH9) đến sự hình thành bào tử theo thời gian , tuy nhiên lại khơng thể nhận thấy sự khácnhautrongtácđộngkhácnhaugiữahaimức pHnày.Cĩthể,dothờigianxửlívà theo dõicủachúng tơingắnnênkhơng thểnhậnthấyđược sựtácđộngkhác nhaucủa haimứcpHnày.
Quahai bảng kếtquả Bảng 4.4 và Bảng 4.5, chúng tơi sosánh thấycĩ sự khác biệtvềsốlượngbàotửtrung bìnhkhixửlíbàotửbằngnhiệtđộsovới xửlíbằngpH. Tuynhiên kết quả xử lí thống kê chothấy giữa hai cách xửlí bàotử cĩ sự khác biệt khơngcĩýnghĩavềmặtthốngkê.
3 2 Sốlƣợngvi khuẩn (tínhtheo 10 logarit) 8 6 4 2 0 0 3 5 7 Thời gian (giờ) pH7 pH6 pH9
Biểuđồ4.5.ẢnhhƣởngcủapHđếnsựhìnhthànhbàotửcủavikhuẩn B.subtilis
3 3
PHẦNV.KẾTLUẬNVÀĐỀNGHỊ
5.1.Kếtluận
Sauthờigian thựchiệnđềtàichúngtơiđãrútranhữngkếtluậnsau:
Đặc điểmsinhhọc, sinhhố củavi khuẩn Bacillus subtilis do phịng thínghiệm visinhkhoaChăn nuơiThúycungcấpchothấycácđặcđiểmvềhìnhthái nuơicấyvà phảnứngsinhhốphùhợp.
phútnghỉ)thìchếđộnuơicấylắcchosốlượngvikhuẩncaohơn.
Khảosát ảnhhưởng của4 loạimơi trườngkhác nhau (TSB,TSB+ 1%glucose, TSB+1%caonấmmen,TSB+ 1%glucose+ 1%caonấmmen) thìmơi trườngTSB cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, 3 mơi trường cịn lại là những mơi trường phù hợp choBacillussubtilispháttriển.
KhảosátảnhhưởngcủapHmơitrường(pH7và7,5),thờigian(24,36và48giờ) và nhiệt độ nuơi cấy (nhiệt độ phịng,37oC) thì ở pH7, thời gian 48 giờ và nhiệt độ nuơicấy37oCchosốlượngvikhuẩn lớnnhất.
Khảosátảnh hưởngcủanhiệtđộ (50, 70),pH (6,9) vàthời gian xửlí (3, 5và7 giờ) đếnsự hìnhthành bào tửthì khixử líởcác nhiệtđộ vàpH nàycĩsự ảnh hưởng đếnquátrìnhhìnhthànhbàotửcủavikhuẩnBacillussubtilis.
5.2.Đềnghị
Khảosátthêm nhiềuchủngvikhuẩn Bacillussubtilisđểchọnchủngcĩkhảnăng pháttriểnmạnh.
Khảosát thêm nhiều loại mơi trường, nhiệt độ, pH vàthời gian nuơi cấyđể xác địnhđiềukiệnthíchhợpchovikhuẩnBacillussubtilisphát triển.
Khảosátthêm nhiều điềukiện xửlýbào tửđể tìmđượcđiều kiệnthích hợp cho sựhìnhthànhbàotửcủavikhuẩn Bacillussubtilis.
`
3 4
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNGVIỆT
khuẩn Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis. LVTN, bộ mơn cơng nghệsinhhọc,TrườngĐạiHọcNơngLâmTp.HCM.
2. TơMinh Châu,2000.Giáorìnhthựctậpvisinhvậthọc..
3. NguyễnLân Dũng,1983.Thực tậpvisinhvật.Nhàxuấtbảnđạihọcvàtrung