- Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu.
b. Giải trình tự ADN
Phương pháp chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ vi sinh vật là xác định chính xác trình tự chuỗi ADN của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Phương pháp giải trình tự ADN phát triển nhanh chóng, kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn theo sinh học phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Các gene bảo thủ được giải trình tự làm cơ sở để xác định vị trí của sinh vật nghiên cứu, trong khi đó các trình tự không tương đồng (khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt hóa cũng như xác định mối quan hệ giữa các cá thể gần với nhau.
+ Nguyên tắc:
Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo ra các mảnh ADN được đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các mảnh có các base đánh đấu được tách ra trên gel polyacrylamid Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp: phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) và phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzym được dùng phổ biến hơn cả.
+ Phương pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger:
Phương pháp kết thúc phản ứng chuỗi được thực hiện dựa trên việc nhân ADN từ sợi khuôn khi có đoạn ADN mồi với xúc tác của Klenow hay T7-ADN polymerase và 4
loại deoxyribonucleotid (dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứng được tiến hành đồng thời và trong mỗi phản ứng thì có một loại dNTP bị thay đổi bởi một dẫn xuất để làm dừng phản ứng (ddNTP). Kết quả là phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệu cho mỗi một base xác định xảy ra một cách ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng. Trình tự của ADN được xác định trên gel. Đầu tiên phương pháp này được xây dựng cho xác định trình tự sợi ADN đơn tạo ra bằng cách tách dòng ADN vào vectơ thực khuẩn thể M13 (Sanger và cộng sự, 1978). Sau đó phương pháp xác định trình tự sợi đôi ADN đã được Chen, William (1986) mô tả khi tách dòng ADN vào plasmid. Ngày nay người ta lựa chọn phương pháp Sanger để giải trình tự ADN cho nghiên cứu phân loại và xác định typ vi sinh vật thay cho phương pháp hóa học.
Một số lợi thế của phương pháp này ở chỗ: Phương pháp này đơn giản và không tốn nhiều thời gian như phương pháp hóa học. Khi nghiên cứu phân loại và xác định typ thì các gene nghiên cứu có độ bảo thủ nhất định vì vậy ta có thể dùng chung mồi cho nhiều đối tượng khác nhau. Một trong hạn chế của phương pháp này ở chỗ các đoạn ADN cần được tách dòng trước khi tiến hành giải trình tự ADN. Tuy nhiên cho đến nay người ta đã cải tiến phương pháp này để có thể giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR.
+ Giới thiệu kỹ thuật giải trình tự ADN theo Sanger:
Có hai phương pháp: Phương pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang).
- Phương pháp truyền thống:
Các bước chính cho giải trình tự ADN như sau: Chuẩn bị ADN khuôn
Bắt cặp ADN khuôn và mồi
Tiến hành phản ứng giải trình tự ADN
Tách sản phẩm trên gel polyacrylamid biến tính với urea. Đọc kết quả.
Tuy nhiên cần chú ý một số điểm sau: 1. Chuẩn bị ADN khuôn. 2. Điều kiện bắt cặp mồi.
3. Thực hiện phản ứng giải trình tự ADN. 4. Tách sản phẩm trên acrylamid gel. 5. Đọc kết quả.
Một số điểm cần được chi tiết thêm cho mỗi bước như sau: 1, Chuẩn bị ADN khuôn:
M13) hay sợi đôi ADN. Việc đọc trình tự theo sợi đơn thường cho kết quả là kích thước đoạn gene đọc dài và độ chính xác cao. Ngày nay người ta thường đọc sợi đôi vì việc chuẩn bị mẫu dễ dàng hơn, ngoài ra khi sử dụng hai phản ứng với hai mồi tương thích thì quá trình đọc lại chính xác hơn. Đó là ưu thế của cách đọc sợi đôi ADN. Do vậy, rất cần đọc kết quả từ cả hai sợi ADN. Hiện nay phương pháp đọc trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR đang ngày càng trở lên phổ biến.