- Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu.
5, Đọc trình tự gene:
Hiện nay kỹ thuật đọc phim tự động đã thay thế công việc đọc trình tự ADN buồn tẻ trước đây. Có hàng loạt các thiết bị từ loại có thể ghi lại trình tự dựa vào việc chọn từng loại base đến những thiết bị có thể thực hiện được toàn bộ quá trình này một cách tự động.
Hy vọng rằng với những bàn luận ngắn gọn này sẽ giúp bạn làm quen dần với nhiều loại kỹ thuật khác nhau. Ngày nay các thiết bị giải trình tự tự động càng trở lên thông dụng và việc sử dụng loại thiết bị và hóa chất khác nhau rất đa dạng. Việc chọn lựa thiết bị, hóa chất và phương pháp thích hợp để giải trình tự ADN nhanh, chính xác và kinh tế là điều cần được quan tâm đến.
* Một số phương pháp cụ thể thường được dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN.
Phương pháp 1: Tinh sạch Plasmid cho giải trình tự ADN.
Hiện nay có nhiều kỹ thuật tinh sạch plasmid khác nhau, phương pháp được trình bày dưới đây là phương pháp thu được plasmid có độ tinh sạch cao, có thể dùng cho cả giải trình tự ADN thủ công và tự động hóa. Quá trình này là cải tiến phương pháp sử
dụng dịch kiềm làm tan tế bào, sau đó sử dụng sắc ký qua cột trao đổi ion. Cũng như các sản phẩm được lưu hành trên thị trường của các công ty, hạn chế lớn nhất của phương pháp này là giá thành của nhựa trao đổi ion tương đối đắt. Thực tế có rất nhiều công việc phải giải trình tự một cách thủ công và các cán bộ nghiên cứu đã tìm ra nhiều phương pháp tinh sạch khác nhau để thu nhận ADN đạt độ sạch cần thiết, thậm chí có thể dùng cho giải trình tự ADN tự động. Tuy vậy, nhiều người vẫn thích sử dụng cột trao đổi ion, kết quả có thể đọc được tới 600 bps hoặc nhiều hơn nữa.
Quá trình tinh sạch như sau:
+ Nuôi cấy vi khuẩn mang plasmid trên môi trường chọn lọc với kháng sinh tương ứng (khoảng 3 ml).
1, Phân 3 ml môi trường LB chứa 100 mg/ml apicilin trong ống nghiệm vô trùng (12X100 nm có nút).
2, Vô trùng đầu que cấy trên lửa và làm nguội trên mặt đĩa thạch.
3, Lấy sinh khối từ một khuẩn lạc và đưa vào ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy trên.
4, Nuôi cấy vi khuẩn 37oC qua đêm có lắc vừa phải.
+ Chuẩn bị ADN dùng cột Qiagene:
Các cột Qiagene được chuẩn bị dễ dàng và nhanh để tinh sạch ADN không cần dùng gradient CsCl. ADN được chuẩn bị theo phương pháp này đạt kết quả rất tốt cho việc biến nạp và giải trình tự gene.
Có hai chú ý quan trọng khi dùng cột Quiagene là: (1) Không sử dụng quá nhiều mẫu lên cột, điều này rất quan trọng vì nếu dùng thể tích quá nhiều kết quả là sẽ có nhiều protein ảnh hưởng đến khả năng bám cột của ADN. Với cách này có thể nhận được lượng ADN có chất lượng cao hơn từ thể tích ít hơn. Nếu như lượng ADN thu được ít từ lần thử đầu tiên thì cần thực hiện đúng theo chỉ dẫn để lần thử thứ 2 với thể tích lớn hơn. Khi có một loạt thể tích mẫu được Quiagene khuyến cáo lên cột để đạt được hiệu suất tinh sạch cao nhất thì nên dùng lượng dịch lên cột có thể tích nhỏ nhất. (2) Đảm bảo cột phải được rửa hai lần trước khi giải phóng ADN ra khỏi cột, điều này cũng rất có ý nghĩa vì việc rửa như vậy sẽ loại trừ được protein và các thành phần tạp nhiễm khác.
+ Các bước dùng cột trao đổi Qiagene (tài liệu hướng dẫn sử dụng
Quiagene):
1. Ly tâm khoảng 1,3 ml dịch vi khuẩn mang plasmid. Làm tan với 0.3 ml đệm P1 có RNase, chuyển sang tube mới.
2. Thêm vào 0.3 ml đệm P2 và trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng 5 phút (không nên để lâu hơn).
3. Thêm vào 0.3 ml đệm P3 trộn đều ngay nhưng phải nhẹ nhàng, ly tâm ở 4oC trong 30 phút với tốc độ 15000 v/phút. Thu lấy phần trên tủa.
4. Ly tâm lại như bước 3 một lần nữa để loại các phần cặn nếu có.
hết tự do.
6. Đưa phần dịch thu được ở bước 4 lên cột và để tự chảy qua cột. 7. Rửa cột 2 lần, mỗi lần 1 ml đệm QC.
8. Thu ADN với 0.8 ml đệm QF.
9. Kết tủa ADN với 0.7 thể tích isopropanol (trước đó đưa về nhiệt độ phòng). Ly tâm 15000 v/phút tại 4oC.
10. Rửa ADN thu được với ethanol 70%, để khô 5 phút và hoà tan lại trong thể tích đệm thích hợp (25ml). Chú ý trong trường hợp mẫu dùng cho giải trình tự ADN tự động huỳnh quang thì hoà tan mẫu trong nước.
Nói chung sử dụng cột Qiagene thu được trên 90% ADN và thường được dùng cho tinh sạch Plasmid và cosmit (kích thước dưới 2 Kbs đến lớn hơn 50 Kbs). Số lượng plasmid thu nhận được từ tế bào E.coli phụ thuộc vào hệ tế bào chủ, loại plasmid từ thấp trung bình đến số lượng plamid cao và điều kiện nuôi cấy (có thể tham khảo tài liệu liên quan từ các chỉ dẫn của Qiagene để quyết định số lượng tế bào dùng để xử lý cho mỗi loại kích thước cột).
Chú ý cách làm sạch và tái sử dụng cột: 1, Thêm ethanol đầy vào cột, ly tâm. 2, Bỏ ethanol và ly tâm lại một lần nữa. 3, Lặp lại bước 1 và 2 với nước cât.
4, Giữ cột ở trạng thái khô cho đến lần sử dụng về sau.
(Cột có thể được dùng cho nhiều lần tuy nhiên khi muốn tinh sạch ADN dùng cho tách dòng thì nên dùng cột mới).
Các loại dịch đệm dùng cho cột Qiagene:
Đệm P1 50 mM Tris -HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, Rnase A
pha ngay trước khi dùng trong đệm P1 nồng độ 100 μg/ml Bảo quản 4oC
Đệm P2 200 mM NaOH,1%SDS Nhiệt độ phòng
Đệm P3 2,55M KAc, pH 4,8 Nhiệt độ phòng
Đệm QBT 750mM NaCl,50mM MOPS,15% ethanol, pH 7,0, 0,15% Triton X-100
Nhiệt độ phòng Đệm QC 1M NaCl, 50mM MOPS, 15% ethanol, pH 7,0 Nhiệt độ phòng Đệm QF 1,25M NaCl, 50mM MOPS, 15% ethanol, pH 8,2 Nhiệt độ phòng
Phương pháp 2. Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADN
Giới thiệu chung:
Phương pháp này giới thiệu cách đổ gel, lên mẫu và chạy gel giải trình tự ADN. Có nhiều cách đổ gel, có thể tham khảo các cách khác nhau để chọn cách tiện ích nhất.
Điều quan trọng nhất là các bản kính phải được rửa sạch tuyệt đối.
1, Mang găng tay và loại bỏ hết bột găng tay đi. Rửa bản kính một lần với nước nóng. Sau đó dùng bàn chải rửa với 0.5N NaOH. Lau bản kính với dung dịch Alconox hay chất tẩy rửa có chức năng tương đương. Sau đó rửa sạch lại bằng nước.
2, Rửa các bản kính với nước trao đổi ion sau đó dựng lên giá cho khô, tránh bụi bám vào kính. Lau với ethanol và dùng giấy Kimwipes hay Scott Utinity để lau cho sạch không tạo vết. Kiểm tra lại bụi bám vào kính để lau cho sạch, sau đó kính được lau bằng lớp dịch Rain-X hay Sigmacott, Gel Slick của hãng AT Biochem. Mục đích dùng chất này là giúp cho việc đổ gel dễ dàng hơn và gel không bị dính vào các bản kính.
3, Rửa lại bản đệm cách gel (spacer) với nước đặt vào dọc theo hai cạnh đối xứng của bản kính.
4, Ghép hai bản kính với nhau. Đặt cẩn thận hai bản kính bằng nhau sao cho hai bản spacer sát tận cuối bản gene (tạo mặt phẳng cùng với hai bản kính). Nếu không đảm bảo mặt phẳng thì dễ bị chảy gel trong quá trình đổ gel. Kẹp 2 cạnh của gel tại 3 vị trí.
5, Chuẩn bị gel acrylamid 8% Long Ranger (Hoefer Rig). Trộn đều hỗn dịch:
16 ml Acrylamid Long Ranger (LR) 50%. 5 ml 10X TBE
70 ml 10M Urea (46 gam)
Đưa đến thể tích 100 ml với nước
Cho vào 800 μl 10% Ammonium persulphat. 50 μl TEMED.
Quá trình polyme hóa được thực hiện trong 15 -20 phút.
Chạy gel LR trong dải nhiệt độ 50-55oC, nhiệt độ cao hơn 55oC sẽ phá các liên kết acrylamid LR gel là dạng cải biến cho gel acrylamid có một số ưu điểm sau: Thứ nhất là LR gel với nồng độ cao hơn nhưng việc chạy gel thì cũng như gel có nồng độ thấp thông thường, ví dụ LR gel 5% tương đương 4% gel acrylamid với bisacrylamid Thứ 2 là LR gel có khả năng phân giải cao hơn và chạy với tốc độ nhanh hơn 30-40% gel thông thường, gel LR khô nhanh hơn và không bị dính.
Một số chú ý khi thao tác::
a. Trộn gel nhẹ nhàng (tránh trộn mạnh).
b. Hút dịch acrylamid bằng pitpet hay có thể dùng cốc đong.
c. Đặt bản kính nghiêng 15o và đổ gel bằng cốc đong hay pipet. Kiểm soát tốc độ đổ gel bằng góc nghiêng. Tránh để dòng gel khi đổ ngắt quãng vì điều này sẽ dẫn đến tạo bọt. Nếu phải dừng lại để hút dịch mới vào syringer thì lúc đó phải hạ dần bản kính xuống vị trí nằm ngang trước khi dừng đổ gel. Sau đó lấy dịch gel mới vào syringer và tiếp tục đổ gel trước khi gel lên khỏi vị trí nằm ngang. Cứ thao tác như vậy đến khi đổ đầy bản gel.
Nếu xuất hiện bọt khi đổ gel thì phải dừng lại ngay và nghiêng tấm kính để cho bọt khí đi lên, có thể gõ nhẹ tay vào bản kính để cho bọt khí đi lên hết. Phải loại hết bọt khí ra khỏi gel, sau đó mới tiếp tục đổ gel.
6, Đặt gel nằm ngang và đưa cạnh bằng của lược răng cá mập vào gel, tạo một góc hơi nghiêng nhằm tránh tạo bọt khí. Chắc chắn rằng đã đặt cạnh bằng của lược vào phía trên của gel và phần răng cá mập sẽ nằm dọc theo đỉnh của bản kính dài (lược sẽ nằm ngược với vị trí trong hình 1.10). Bổ sung thêm gel và đẩy thêm lược vào đúng vị trí và cố định lược lại bằng kẹp để tránh xê dịch.
7, Bao bọc gel với giấy nilon SaranWrap để tránh gel tiếp xúc với không khí. Ngoài ra có thể thấm giấy lọc với đệm TBE để đậy lên. Điều này giữ cho gel luôn ẩm và tránh gel tiếp xúc với oxy (oxy làm cản trở quá trình polyme hóa).
8, Quá trình polyme xảy ra từ 30 phút đến 1 giờ. Để xác định polyme hóa có thể hút một ít gel vào pipét pastuer và để cho đến khi quá trình polyme hóa xảy ra. Hoặc có thể lấy gel cho vào ống falcon và đậy chặt nắp lại, trong nhiều trường hợp thì gel chỉ nên polyme hóa trong 15-20 phút hoặc nhanh hơn. Nếu quá trình polyme hóa không xảy ra thì lại phải tiến hành rửa kính và đổ lại gel. Chú ý nhiều khả năng quá trình polyme hóa không xảy ra do Ammonium persulphat không còn tốt khi dùng lâu, nên chuẩn bị dịch này để dùng trong tuần. Điều cần chú ý nữa là gel phải được bọc kỹ với SaranWrap để qua đêm.
9, Chuẩn bị gel trước khi chạy: a. Lấy SaranWrap ra khỏi gel.
b. Đặt gel vào thiết bị điện di (bản kính dài đặt áp vào thiết bị), chắc chắn là đã cắt bỏ lớp băng dính ở đáy gel để việc điện di xảy ra.
c. Đổ 0,5X TBE vào bể đệm dưới của thiết bị, lượng đệm cần phải đủ để cho bản gel nằm trong đệm.
d. Đổ đệm vào bể trên của thiết bị, đảm bảo gel nằm dưới lớp đệm. Kiểm tra xem đệm có bị chảy ra hay không.
e. Chạy thử 20-30 phút tại hiệu điện thế 2000V (phải cẩn thận vì rất nguy hiểm), sau đó nhiệt độ của bản gel nên đạt tới 50oC.
10, Xử lý nhiệt với các mẫu ADN điện di tại 85oC trong 5 hút và trộn đều, để trên đá cho đến khi lên mẫu.
11, Tắt nguồn điện vào thiết bị điện di (nhớ ngắt nguồn điện vào thiết bị trong bất kỳ trường hợp nào khi thao tác với thiết bị).
12, Trong khi xử lý nhiệt với các mẫu thì rửa bề mặt với đệm trong bể điện di, dùng pipet hay syringer 60 ml. Mục đích của thao tác này là loại lớp urea trên bề mặt gel.
13, Đánh dấu vị trí đỉnh của mặt gel trên bản kính trước của gel.
14, Đặt lược răng cá mập lên mặt gel, các răng được đặt trên mặt gel và ngập sâu vào mặt gel khoảng 1 mm. Chắc chắn là vùng không gian giữa các răng được giới hạn giữa các răng và gel. Như vậy phần lược răng cá mập trở thành các cạnh bên của giếng, bề mặt gel là đáy của giếng tra mẫu (hình 1.10).
Hình 1.10. Vị trí đặt lược sau khi đổ gel.
Phải đảm bảo chắc chắn đã làm sạch bề mặt gel trước khi đặt lược răng cá mập lên trên gel. Nếu không thực hiện việc này sẽ không đọc được phần kết quả phía trên của gel. Nếu quyên thực hiện bước này có thể rửa sạch từng giếng tra mẫu nhưng việc này sẽ khó khăn hơn. Nếu lên nhiều mẫu thì trước đó cần phải phải làm sạch giếng vì urea sẽ khuyếch tán và tích tụ tại bề mặt gel tại thời điểm lên mẫu.
15, Việc xử lý nhiệt ở 85oC đối với các mẫu điện di nhằm làm biến tính ADN, chỉ lên khoảng 2-4 ml mẫu cho mỗi giếng (lên mẫu theo thứ tự ACGT), có thể dùng bút để viết lên kính nhằm tránh nhầm lẫn.
16, Quá trình điện di với hiệu điện thế 2000V cho đến khi màu BPB (Bromophenolblue) di chuyển đến tận cùng bảng gel (1-2 giờ). Nếu chạy gel có gradient muối sẽ cho phép đọc được nhiều base hơn trên một gel do việc làm ngắn lại khoảng cách giữa các băng ADN ở phần cuối bản gel. Nên dừng điện di từ 45 phút – 1 giờ. Tắt nguồn điện, bổ sung 1/2 thể tích 3M NaOAc vào bể đệm đáy, trộn đều. Lại tiếp tục công việc chạy gel cho đến khi BPB di chuyển đến cuối bản gel. Chú ý sự có mặt của muối nồng độ cao sẽ dẫn đến nhiệt độ tăng, do đó cần phải kiểm soát nhiệt độ của quá trình chạy gel nhằm tránh vỡ kính và hỏng gel.
17, Lấy bản gel ra khỏi thiết bị, chú ý bể đệm đáy chứa chất phóng xạ, các nucleotid dư sẽ đi ra khỏi bản gel.
18, Đổ bỏ bể đệm trên.
19, Đặt bản gel trên bàn thí nghiệm sao cho tấm kính ngắn lên trên. Phủ lên một lớp SaranWrap, dùng đá lạnh đặt lên trên khoảng 2 phút để cho gel co lại, dùng thanh nhựa tách các lớp kính ra, giữ nguyên không cho tấm kính trên tiếp xúc lại với gel vì như vậy gel sẽ dính và bị vỡ. Lúc này gel sẽ chỉ dính vào tấm kính dưới không có silicon được phủ khi đổ gel.
20, Đặt tấm giấy Whatman lên trên gel và vuốt đều nhẹ nhàng, lúc đó gel sẽ dính vào giấy và có thể lấy ra dễ dàng (Chú ý trong trường hợp sử dụng chất phóng xạ là S35 thì nên cố định mẫu theo cách dưới đây).
21, Sau khi lấy gel ra hỏi tấm kính đáy thì bọc gel với SaranWrap, chú ý tránh không khí đi vào giữa lớp SaranWrap và gel, điều này sẽ cản trở ảnh phóng xạ trên phim.
22, Có thể đưa vào thiết bị sấy gel.
23, Sấy gel trong khoảng 45 phút tại 80oC.
24, Đặt phim X-ray theo đúng chỉ dẫn vào gel trong hộp cassette (có phim chỉ có một mặt thì mọi thao tác phải đúng để có ảnh phóng xạ). Thời gian nhận được bức xạ là 12-14 giờ đối với P32 và 24-48 giờ đối với S35.
25, Đọc kết quả.
Cố định gel: Mục đích của bước này là loại bớt urea khỏi gel vì sự có mặt của urea sẽ hạn chế sự phân cách giữa các ADN, các bước được thực hiện như sau:
+ Đặt bản kính có gel vào khay chìm trong hỗn dịch 15% ethanol và 10% acetic acid.
+ Cố định trong 10-15 phút đủ để urea khuyếch tán khỏi gel. + Dùng giấy lọc để thấm hết dịch cố định khỏi gel.
+ Tiếp tục làm theo các bước như quy trình hiện ảnh phóng xạ.
Hóa chất và cách chuẩn bị:
Phương pháp: Giải trình tự ADN sợi kép sử dụng KIT biến tính nhanh với sequenase.
Phương pháp này thích ứng với việc giải trình tự các plasmid sợi đôi. Bắt đầu bằng
việc gây biến tính trong kiềm (NaOH) hoặc glycerol, sau đó kết tủa ADN và bắt cặp với ADN mồi dùng để giải trình tự. Phương pháp giải trình tự ADN với sợi đôi cần lượng