*Sự lựa chọn mẫu cấy
Mẫu cấy phải cạnh tranh sinh lý để sống sót trong môi trƣờng nuôi cấy sơ khởi và tạo phản ứng thích hợp. Mẫu cấy còn non sẽ tái sinh tốt hơn mẫu già.
Mẫu thích hợp nhất cho nuôi cấy mô phải có tỉ lệ mô phân sinh hiện diện hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng.
*Môi trƣờng nuôi cấy
Thông thƣờng là môi trƣờng Murashige & Skoog là thích hợp cho phần lớn các trƣờng hợp. Để hình thành chồi nách yêu cầu nồng độ thấp của auxin và cytokinin, để
phát khởi chồi bất định cần nồng độ cao của cytokinin và thêm một lƣợng auxin cân bằng. Để sản xuất callus cần nồng độ cao của auxin kết hợp với nồng độ thấp cytokinin. Ngoài ra đối với vài loại cây trồng còn bổ sung GA3 ngoại sinh 0.1mg/l cho sự phát triển bình thƣờng và nhân giống in vitro.
Sự lựa chọn môi trƣờng agar hay môi trƣờng lỏng là cần thiết, agar làm giá đỡ cho cây nhƣng cây trồng khó hấp thu tốt các dƣỡng chất.
*Điều kiện nuôi cấy Ánh sáng
Mẫu cấy đƣợc đặt trên môi trƣờng nuôi cấy là đƣờng, đƣờng đi vào quang tổng hợp cho cây trồng. Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thu đóng vai trò trong quá trình tạo hình cây nuôi cấy mô.
Thƣờng nuôi cấy ở 2000-3000 lux là tốt nhất.
Nhiệt độ
Ngoài ánh sáng, yếu tố môi trƣờng khác có ảnh hƣởng rõ ràng là nhiệt độ. Hầu hết nuôi cấy thích hợp ở nhiệt độ 20- 250C.
Môi trƣờng in vitro
Môi trƣờng in vitro là môi trƣờng trên và dƣới mặt thạch trong bình nuôi cấy có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển hình thái của cây. Một số vấn đề thƣờng gặp trong môi trƣờng in vitro nhƣ: mức độ quang hợp thấp, không cân bằng CO2, mức độ hấp thu và vận chuyển các chất dinh dƣỡng thấp. Vì vậy cây con in vitro
chậm phát triển. *Chất kích thích sinh trƣởng - Auxin - Cytokinin - Gibberellins - ABA - Ethylen