Phƣơng pháp ly trích DNA đƣợc thực hiện theo quy trình của Sambrook và ctv, 2001: Phƣơng pháp sử dụng CTAB/NaCl đã có cải tiến. Quy trình thực hiện nhƣ sau:
- Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm dịch vi khuẩn 10.000 vòng/5 phút/4o
C. Rửa sinh khối thu đƣợc với 1ml nƣớc cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (thƣờng 2- 3 lần).
- Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567 μl dung dịch TE và đánh tan bằng vortex, thêm 30 μl dung dịch SDS 10% và đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 – 2 giờ.
- Cho thêm vào 100 μl dung dịch NaCl , hòa tan thật kỹ bằng vortex.
- Thêm vào 80 μl dung dịch CTAB/NaCl ( khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ ở 650C/10 phút.
- Thêm vào 780 μl dung dịch hỗn hợp Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1:v/v). Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 12.000 vòng/10 phút/4oC.
- Thu hết dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào eppendorf mới. Nếu không thể phân biệt mặt phân cách chung giữa các dung dịch có thể ly tâm thêm lần nữa ở tốc độ lớn hơn.
- Chiết xuất dung dịch DNA với Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1:v/v). Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14.000 vòng/10 phút/4oC. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào eppendorf mới (khoảng 500 μl).
- Kết tủa DNA với dung dịch Isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích của dung dịch (khoảng 300 μl) và ủ ở tủ - 20oC/30 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/10 phút/40C. Thu lấy kết tủa sau khi ly tâm.
- Rửa kết tủa bằng Ethanol 70% (khoảng 500 μl).Tốt hơn có thể dùng Ethanol 70% đƣợc làm lạnh – 200C, nghiêng nhẹ qua lại. Ly tâm 13.000 vòng/10 phút/4oC. Đổ cồn ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi.
- Hòa tan kết tủa trong 40 μl dung dịch TE, đem giữ trong tủ mát 40C trong suốt thời gian thử nghiệm.